豬圓環(huán)病毒PCR診斷方法建立及標(biāo)準(zhǔn)制訂.pdf

1、豬2型圓環(huán)病毒(Porcine circovirus 2，PCV2)與近年來(lái)世界各國(guó)普遍發(fā)生的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)密切相關(guān)，該病主要以進(jìn)行性消瘦和多系統(tǒng)病理?yè)p傷為特征，更為嚴(yán)重的是PCV2的感染可以造成免疫抑制，引起其他各種病原的繼發(fā)感染，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成相當(dāng)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本研究建立了檢測(cè)與診斷豬圓環(huán)病毒的PCR方法及同時(shí)檢測(cè)PCV2

2、、PPV和PRV的多重PCR方法。并應(yīng)用此方法對(duì)河南省某大型豬場(chǎng)不同類(lèi)型豬群疑似PCV2進(jìn)行檢測(cè)，旨在為PCV2的流行病學(xué)、疫病預(yù)防等相關(guān)領(lǐng)域的研究提供依據(jù)。主要內(nèi)容及結(jié)果如下： (一)根據(jù)已報(bào)道的PCV2基因組序列，設(shè)計(jì)并合成了3對(duì)寡核苷酸引物，通過(guò)優(yōu)化PCR的條件，成功地從PCV2感染的細(xì)胞中擴(kuò)增出487bp片段，回收PCR產(chǎn)物測(cè)序，并用EcoR Ⅰ進(jìn)行酶切，得到301 bp、186 bp的兩條帶，與預(yù)期的結(jié)果相符合，證實(shí)了

3、該擴(kuò)增片段的特異性，并對(duì)PRV DNA、PPV DNA和正常PK-15細(xì)胞基因組DNA的PCR擴(kuò)增均為陰性，證明了PCR檢測(cè)方法的特異性，PCR檢測(cè)PCV2 DNA的最小量為0.1 pg。 (二)在建立的PCV2和豬偽狂犬病毒(PRV)的單相PCR基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)擴(kuò)增條件的篩選，最終成功地建立了PCV2和PRV的復(fù)合PCR診斷方法，即利用一次PCR反應(yīng)，可同時(shí)擴(kuò)增PCV2的487 bp和PRV的355 bp特異性片段，而擴(kuò)增相應(yīng)的

4、培養(yǎng)細(xì)胞(PK15)核酸結(jié)果均為陰性，對(duì)PCV2和PRV的最低檢出量分別為100 pg和10 pg的DNA。該方法適合對(duì)PCV2和PRV的聯(lián)合檢測(cè)和鑒別診斷。 (三)建立一種同時(shí)檢測(cè)PCV2、PPV和PRV的多重PCR方法。根據(jù)GenBank上發(fā)表的PCV2、PPV和PRV基因序列，針對(duì)各自保守區(qū)各設(shè)一對(duì)特異性引物，用這3對(duì)引物對(duì)同一樣品中的PCV2、PPV和PRV進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)其它幾種病原的PCR擴(kuò)增結(jié)果均為陰性；敏感性測(cè)定結(jié)果