轉(zhuǎn)Bt基因水稻對(duì)土壤微生物的影響及稻田二化螟遺傳多樣性研究方法的建立.pdf

1、水稻等主糧轉(zhuǎn)基因育種具有對(duì)目標(biāo)性狀定向變異、育種周期短等諸多優(yōu)點(diǎn)，但食品安全與生態(tài)安全等方面的基礎(chǔ)研究工作有待深入、廣泛開(kāi)展，這方面的研究將有助于轉(zhuǎn)基因作物穩(wěn)妥、科學(xué)、安全地推廣應(yīng)用。
　　本研究擬采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和高通量測(cè)序技術(shù)研究稻田土壤微生物尤其是土壤重要功能微生物對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因水稻的響應(yīng)?；赟anger測(cè)序技術(shù)和PCR-DGGE技術(shù)，建立了兩種轉(zhuǎn)基因稻田昆蟲(chóng)遺傳多樣性的研究方法。
　　基于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，對(duì)種植轉(zhuǎn)Bt基

2、因水稻及其親本稻的稻田土壤微生物的豐度進(jìn)行連續(xù)兩年的追蹤，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，非轉(zhuǎn)基因水稻種植稻田細(xì)菌豐度變化范圍在3.28-17.7×106 CFU/g干土，真菌豐度變化范圍在2.56-8.09×104 CFU/g干土，放線菌豐度變化范圍在0.36-4.52×106 CFU/g干土；轉(zhuǎn)基因組細(xì)菌豐度變化范圍在3.01-15.2×106 CFU/g干土，真菌豐度變化范圍在2.13-12.4×104 CFU/g干土，放線菌豐度變化范圍在0.31

3、-3.9×106 CFU/g干土。轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因組間的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　基于454焦磷酸測(cè)序技術(shù)，分別對(duì)細(xì)菌16S V1-V3區(qū)和真菌ITS ITS1-ITS4區(qū)進(jìn)行了測(cè)序，兩年共得到498378條細(xì)菌有效序列，765283條真菌有效序列?；?012年測(cè)序結(jié)果比對(duì)分析確定95屬細(xì)菌，確定182屬真菌。非轉(zhuǎn)基因稻田土壤細(xì)菌群落的Chao和Shannon指數(shù)分別為1965.33和6.67234，真菌的Chao和Shann

4、on指數(shù)分別為1654.23和3.791402；轉(zhuǎn)基因組土壤細(xì)菌Chao和Shannon指數(shù)分別為1798.35和5.95488，真菌的Chao和Shannon指數(shù)分別為1792.38和3.69263，兩組間未發(fā)現(xiàn)明顯差異?；?013年測(cè)序結(jié)果，確定104屬細(xì)菌，確定151屬真菌，比較分析轉(zhuǎn)基因組和非轉(zhuǎn)基因組之間的Chao、Shannon等指數(shù)，兩組間也未發(fā)現(xiàn)明顯差異。
　　研究Anaeromyxobacter、Nitraspi

5、ra、Dactylella等重要土壤功能細(xì)菌和真菌對(duì)轉(zhuǎn) Bt基因水稻的響應(yīng)，分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因組中Anaeromyxobacter、Nitraspira、Thiobacillus三個(gè)屬在樣品中所占的比例大于非轉(zhuǎn)基因組，Dactylella、Taifanglania兩個(gè)屬在樣品中所占的比例小于非轉(zhuǎn)基因組，但這種差異不明顯。
　　本研究工作采集了湖南、江西兩地稻田各30只二化螟樣本，并從中各隨機(jī)選擇了12個(gè)樣本進(jìn)行了研究，通過(guò)二化螟樣本

6、的COⅠ基因的測(cè)序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，COⅠ基因的35~692 bp區(qū)段存在豐富的多態(tài)（在658個(gè)堿基中檢測(cè)到173個(gè)多態(tài)位點(diǎn)），因此該區(qū)段非常適合開(kāi)展二化螟種群遺傳多樣性的分析。結(jié)合COⅠ基因序列數(shù)據(jù)，本研究自行設(shè)計(jì)了可用于DGGE分析的引物，使用PCR-DGGE來(lái)研究二化螟的遺傳多樣性。DGGE指紋圖譜與常規(guī)測(cè)序數(shù)據(jù)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)結(jié)果基本一致。
　　本工作獲得的轉(zhuǎn)基因稻田的可培養(yǎng)微生物和不可培養(yǎng)微生物數(shù)據(jù)，為下一步深入研究轉(zhuǎn)Bt基