全反式維甲酸誘導大鼠腸神經系統(tǒng)發(fā)育異常的實驗研究.pdf

1、目的：利用全反式維甲酸（all-trans retinoic acid, ATRA）制作大鼠腸神經系統(tǒng)（Enteric nervous system）發(fā)育異常的動物模型，應用蛋白基因產物9.5（protein gene product9.5, PGP9.5）及突觸素(synaptophysin, SYP)動態(tài)觀察 ENS在胚胎發(fā)育過程的陽性表達及變化并進行透射電鏡超微結構研究，以期了解ENS發(fā)育及ATRA是否誘導ENS異常發(fā)育，為臨床防

2、治ENS發(fā)育異常誘發(fā)的疾病提供實驗基礎。
　　方法：
　　1.實驗一
　　40只健康成熟未孕的SD雌鼠，體重250～300g，由寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心提供。雌雄大鼠按1：1比例于午夜合籠，上午8:10-9:10時檢測有陰道栓排出的雌鼠，即認為已交配，此日標為妊娠第0天（Embryonic day0，E0），正常飼養(yǎng)。將已孕雌鼠30只隨機分為2組，每組15只。實驗組于E10將ATRA按100 mg/kg一次性灌胃；對照

3、組于E10給予體積(2.5 mL/kg)橄欖油，繼續(xù)飼養(yǎng)。兩組分別于E14-20腹腔麻醉下行剖宮術。檢查判定所有胚胎存活數量及畸形并記錄。制作結直腸段標本，行 HE常規(guī)染色及PGP9.5和SYP免疫組化。已知陽性切片作陽性對照，磷酸鹽緩沖液代替一抗作空白對照。圖像分析、采圖、數據記錄分析。
　　2.實驗二
　　已孕母鼠8只隨機分為2組，每組4只。實驗組于E10將ATRA按100 mg/kg灌胃；對照組于E10給予體積(2.5

4、 mL/kg)橄欖油，繼續(xù)飼養(yǎng)。兩組于E21腹腔麻醉下行剖宮術。制作結直腸電鏡標本，預切片定位，超薄切片，透射電鏡觀察，拍片記錄分析。
　　結果：
　　1、免疫組織化學：
　　（1）對照組: E16，在直腸腸壁內可見散在稀疏分布的棕色 PGP9.5陽性細胞，直腸上端結腸壁內未能見SYP陽性細胞。從E16-18，PGP9.5環(huán)肌漿膜側出現陽性細胞，成散在單個出現，粘膜下陽性細胞少見。直腸壁內可見SYP棕黃色成條索狀的陽性

5、表達，主要分布在腸壁漿膜下層。E20， PGP9.5陽性細胞呈黃褐色團簇狀，環(huán)肌層和縱肌層結構清晰，排列整齊，粘膜下可見陽性細胞。SYP在E20陽性表達增強。
　　（2）實驗組: E16直腸肌間組織開始分化，結構整齊，PGP9.5在直腸中可顯示散在分布的陽性細胞，與正常相比無明顯改變，直腸大部分未見SYP陽性細胞。E18開始，近端直腸可見PGP9.5陽性表達，直腸壁內可見棕黃色成條索狀的SYP陽性表達，但是與正常相比，發(fā)育滯后，體

6、積較小，分布稀疏。E18-E20陽性細胞較正常組密度減低。
　　2、透射電鏡超微結構觀察：
　?。?）對照組：神經叢主要分布在環(huán)形肌和縱行肌之間，肌間結構排列整齊，細胞間質內可見微管、微絲、線粒體和密集的核糖體，有無髓神經纖維分布，軸突終末都有突觸聯系。
　?。?）實驗組：肌層肌間結構紊亂，可見軸突變性或偶見不典型突觸結構，未見典型無髓神經纖維，微管、微絲顯示不清，各種細胞器結構模糊，線粒體腫脹。不成熟神經膠質細胞分布