骨橋蛋白調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞對(duì)乙肝病毒的反應(yīng).pdf

1、研究背景及目的
　　 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染目前仍是嚴(yán)重影響中國(guó)乃至世界人類健康的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題。但目前發(fā)病機(jī)制不明。
　　 病毒性肝炎的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中均與免疫細(xì)胞的活化及細(xì)胞因子的產(chǎn)生有密切的關(guān)系。樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DC)在乙型肝炎病毒的識(shí)別及抗原呈遞過(guò)程中起重要作用，影響病毒性肝炎病理生理過(guò)程中Th1、Th2的活化。研究發(fā)現(xiàn)DC既可誘導(dǎo)對(duì)肝炎病毒的

2、免疫，又可誘導(dǎo)免疫耐受，取決于DC的活化狀態(tài)。并有研究發(fā)現(xiàn)在HBV病毒未清除患者中DC的功能受損，并在抗病毒治療后，病毒清除過(guò)程中DC的功能得到一定的恢復(fù)，同時(shí)伴隨著T細(xì)胞功能的恢復(fù)。
　　 骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)是一種分泌性磷酸化糖蛋白，作為免疫調(diào)節(jié)因子，在DC的分化，成熟、存活方面發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)室之前的研究證明OPN在多種肝臟疾病中大量表達(dá)，與肝炎、肝癌、肝臟纖維化的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。

3、　　 本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟诮沂驹谝腋尾《靖腥具^(guò)程中骨橋蛋白對(duì)樹突狀細(xì)胞的成熟以及分泌功能的影響，進(jìn)而研究乙型肝炎中骨橋蛋白對(duì)樹突狀細(xì)胞作用的調(diào)節(jié)作用。
　　 材料及方法
　　 分別取野生鼠與骨橋蛋白基因敲除小鼠骨髓細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并給與IL-4和GM-CSF誘導(dǎo)向DC方向的分化。于第六天分別給予刺激：LPS，HepG2.2.15培養(yǎng)上清，HepG2培養(yǎng)上清，HBcAg，HBsAg，以及空白對(duì)照，共十二組。于48h后收集細(xì)胞及培

4、養(yǎng)上清。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC表面CD分子的表達(dá)，通過(guò)ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子水平。
　　 分別取野生鼠與骨橋蛋白基因敲除小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞，并通過(guò)磁珠分選獲得CD4+T細(xì)胞，野生鼠來(lái)源DC或骨橋蛋白基因敲除小鼠來(lái)源DC分別與野生鼠來(lái)源或骨橋蛋白基因敲除小鼠來(lái)源CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后收集培養(yǎng)上清。通過(guò)ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子水平。
　　 收集健康成人抗凝血分離PBMC并進(jìn)行培養(yǎng)，使用骨橋蛋白中

5、和性抗體阻斷骨橋蛋白作用。分別給予刺激LPS，HBcAg，HBsAg，于培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞和上清。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC表面CD分子的表達(dá)，通過(guò)ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子水平。
　　 結(jié)果
　　 野生型小鼠來(lái)源DC與骨橋蛋白基因敲除小鼠來(lái)源DC，在無(wú)抗原刺激情況下表面CD80,CD86，MHC-Ⅱ分子表達(dá)無(wú)明顯差異，在接受HepG2.2.15培養(yǎng)上清或HBsAg刺激后，骨橋蛋白基因敲除小鼠骨髓來(lái)源DC表達(dá)CD80

6、,CD86，MHC-Ⅱ分子明顯下降，其成熟受到抑制。但HBcAg刺激則使骨橋蛋白基因敲除小鼠來(lái)源DC的CD80,CD86，MHC-Ⅱ分子表達(dá)有所升高。
　　 通過(guò)對(duì)DC分泌IFN-a，IL-12的分析，發(fā)現(xiàn)在無(wú)抗原刺激時(shí)骨橋蛋白缺陷的DC與野生鼠來(lái)源DC相比IFN-a分泌水平降低，在HBV抗原刺激后仍低于野生鼠來(lái)源的DC的分泌水平，IL-12的表達(dá)類似。還發(fā)現(xiàn)，雖然在HBcAg抗原刺激后骨橋蛋白基因敲除小鼠來(lái)源DC表面CD分子表

7、達(dá)升高，但其分泌功能是下降的。
　　 通過(guò)對(duì)不同來(lái)源DC與相同來(lái)源CD4+T的共培養(yǎng)并檢測(cè)Th1細(xì)胞因子以及Th2細(xì)胞因子，發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白基因敲除小鼠來(lái)源DC的共培養(yǎng)與野生鼠來(lái)源DC的共培養(yǎng)相比，培養(yǎng)上清中Th1細(xì)胞因子TNF-a分泌減少，而Th2細(xì)胞因子IL-4，IL-6，IL-10的產(chǎn)生水平升高。
　　 同時(shí)通過(guò)對(duì)相同來(lái)源DC與不同來(lái)源CD4+T的共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)來(lái)源相同的DC和來(lái)源不同的CD4+T共培養(yǎng)對(duì)此實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生細(xì)胞因

8、子無(wú)明顯影響，更進(jìn)一步證明在DC誘導(dǎo)的T細(xì)胞反應(yīng)過(guò)程中DC是否產(chǎn)生骨橋蛋白對(duì)細(xì)胞因子的產(chǎn)生起決定的作用。
　　 通過(guò)人PBMC培養(yǎng)并給予骨橋蛋白中和性抗體封閉骨橋蛋白功能，發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白抗體使DC表面CD80,CD86的水平降低，在HBV抗原刺激后保持同樣的趨勢(shì)，說(shuō)明骨橋蛋白功能被阻斷后，DC的成熟受到抑制。
　　 通過(guò)人PBMC培養(yǎng)并給予骨橋蛋白中和性抗體來(lái)封閉骨橋蛋白功能，發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白功能被阻斷后可導(dǎo)致DC分泌IL-1

9、2功能下降，同時(shí)Th1型細(xì)胞因子IFN-a分泌降低，而Th2型細(xì)胞因子分泌水平升高。
　　 結(jié)論
　　 1.DC在發(fā)育和成熟過(guò)程中能夠分泌大量骨橋蛋白，并且骨橋蛋白在DC發(fā)育以及成熟過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
　　 2.骨橋蛋白的缺乏或不足抑制HBV抗原刺激后DC表面CD80,CD86分子的表達(dá)，使DC的成熟受抑制。
　　 3.骨橋蛋白的缺乏或不足導(dǎo)致HBV抗原刺激后DC分泌細(xì)胞因子水平下降，分泌功能受影響。<