乙型肝炎病毒X蛋白突變體致癌作用及其信號傳導途徑的研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)與肝癌(HCC)的發(fā)生發(fā)展密切相關,乙肝病毒X開放讀碼框編碼的X蛋白(HBx)作為反式激活因子在肝癌的發(fā)生中發(fā)揮重要的作用。但是,HBx致癌作用的分子機理仍不十分清楚。在肝癌組織中發(fā)現(xiàn)HBx基因普遍存在點突變和缺失突變,頻率高達70％,但其作用不清。本研究為了進一步闡明HBx及其突變體在肝癌細胞中的作用和分子機制,從信號傳導途徑等方面探討了野生型HBx促進肝癌細胞生長的分子機制；

2、應用PCR技術從肝癌患者的癌組織和癌旁組織中篩選新的X基因突變體,并對已發(fā)現(xiàn)的HBx羧基端缺失突變體(命名為HBx△127)促進肝癌細胞生長的分子機制進行深入細致的研究。本文從以下三個方面對HBx作用的分子機制進行了研究,主要研究內(nèi)容如下：
　　 第一部分：HBx促進肝癌細胞增殖信號傳導途徑研究。探討了5-脂氧合酶(5-lipoxygenases,5-LOX)在HBx促進肝癌細胞增殖中的作用。應用穩(wěn)定表達HBx的人肝癌細胞系He

3、pG2-Ⅹ和H7402-Ⅹ,通過real-time PCR、免疫印跡和酶聯(lián)免疫分析等方法檢測5-LOX表達水平,結果顯示HBx能夠上調(diào)5-LOX的表達,其細胞培養(yǎng)液中5-LOX代謝產(chǎn)物LIB4的含量增加；在此基礎上,探討HBx上調(diào)5-LOX表達的分子機制。結果顯示,Nuclearfactor-kappa B(NF-kB)的特異性抑制劑PDTC和NF-kB siRNA干擾片段可明顯降低5-LOX的表達,表明HBx通過NF-kB上調(diào)了5-L

4、OX的表達；然后,應用5-LOX的特異性抑制劑MK886和5-LOX siRNA處理HepG2-Ⅹ(or H7402-Ⅹ)細胞,發(fā)現(xiàn)5-LOX通過正反饋促進NF-kB的表達。因此,本研究結果提示,HBx通過5-LOX和NF-kB之間的正反饋調(diào)節(jié)環(huán)促進和維持肝癌細胞的生長。
　　 第二部分：新的乙肝病毒X基因突變體的篩選。為了發(fā)現(xiàn)新的HBx基因突變,我們從60例肝癌病人的癌組織和癌旁組織中篩選HBx基因新的突變體。結果顯示,44例

5、癌組織和癌旁組織里均可檢測到HBx基因,陽性率為73.3％；其中28例癌組織中HBx基因發(fā)生了突變(63.6％),27例的癌旁組織里HBx基因發(fā)生突變(61.3％)；測序結果顯示,癌組織和癌旁組織中HBx點突變分別有35種不同類型,其中癌組織中HBx蛋白第30,33,38,144位氨基酸為熱點突變位點,而第30,33和38位氨基酸伴隨有組合突變(突變率30％),該突變體目前未見報道；癌旁組織中HBx蛋白的第31,40,87,94位氨基酸

6、為熱點突變位點,第94位氨基酸點突變(突變率11％)目前未見報道。在此基礎上,對癌組織中發(fā)現(xiàn)的HBx組合突變體的功能進行了初步研究,通過報告基因檢測了上述HBx組合突變體對NF-k3、hTERT、AP-1和survivin啟動子轉錄活性的影響,結果顯示第30,33和38位HBx的組合突變體與野生型的HBx蛋白結果相同,提示該組合突變并未影響其功能改變。
　　 第三部分：HBx突變體HBx△127促進肝癌細胞增殖信號途徑研究。我們

7、實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)HBx△127與野生型HBx相比具有更強的促進肝癌細胞增殖的能力,但其分子機制尚不清楚。為了探討HBx△127在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用,本研究首先應用人肝癌細胞系HepG2和H7402,通過基因轉染和G-418篩選等方法,獲得了穩(wěn)定轉染HBx△127的肝癌細胞系,分別將其命名為HepG2-X△127和H7402-X△127；在此基礎上,探討了HBx△127對脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase,FAS)

8、和固醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白-1c(Sterol regulatoryelement binding protein1c,SREBP-1c)的影響。應用real-time PCR、熒光素酶報告基因、免疫印跡和酶聯(lián)免疫分析等方法,發(fā)現(xiàn)HBx△127能夠上調(diào)FAS和SREBP-1c的啟動子活性及SREBP-1c的表達；進一步研究發(fā)現(xiàn),5-LOX的特異性抑制劑MK886可明顯抑制上述上調(diào)作用,提示HBx△127可通過5-LOX上調(diào)FAS的轉錄活性和

9、SREBP-1c的表達,進而促進肝癌細胞的增殖；然后,我們進一步觀察了HBx△127對5-L-OX代謝產(chǎn)物LTB4的影響。應用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測,發(fā)現(xiàn)HepG2-X△127和H7402-X△127細胞條件培養(yǎng)液中LTB4的含量與對照細胞組相比明顯增加。當在培養(yǎng)液中外加100nM LTB4時,熒光素酶報告基因檢測結果顯示,FAS的啟動子活性明顯增強。最后,應用FAS的特異性抑制劑cerulenin處理HepG2-X△127