β-catenin在結直腸癌侵襲轉移中的作用及其相關分子機制研究.pdf

1、第一部分結直腸癌浸潤前沿細胞核β-catenin表達與同時性肝轉移關系的研究
　　 研究背景與目的:結直腸癌是消化系統最常見的惡性腫瘤之一，在世界范圍內結直腸癌發(fā)病率每年以2％的速度增長。盡管隨著診療技術的不斷進步結直腸癌患者預后有了很大改善，但病死率仍居高不下。結直腸癌患者病死的主要原因是局部復發(fā)和遠處轉移，結直腸癌最常見的遠處轉移臟器是肝臟。據文獻報道，無肝轉移結直腸癌患者五年生存率接近90％，而發(fā)生肝轉移結直腸癌患者五年生

2、存率僅為19％。結直腸癌患者在確診時，有20％～40％的患者已發(fā)生肝轉移，結直腸癌根治性手術后發(fā)生肝轉移的患者達50％，結直腸癌死亡患者中有肝臟轉移者比例占45％～71％。結直腸癌肝轉移的早期預測及診斷對指導治療，改善患者預后有重要的意義。人們做了大量工作研究影響直腸癌肝轉移的危險因素。就組織病理而言，血管浸潤、腫瘤浸潤深度、腫瘤細胞低分化、淋巴結轉移等是結直腸癌肝轉移的危險因素；從分子生物學來看，已經證明與結直腸癌肝轉移有關的生物分子

3、有表皮生長因子(EGF)、肌動蛋白相關蛋白2(Arp2)、轉化生長因子α(TGF-α)、分化抗原簇44(CD44)和分化抗原簇10(CD10)等。
　　 腫瘤浸潤前沿(ITF)是指位于腫瘤與宿主組織或器官交界處最前沿的3～6層腫瘤細胞或分散的細胞團，研究腫瘤浸潤前沿細胞的特點對于了解腫瘤的生物學特性、指導腫瘤治療及評詁預后有十分重要的作用。結直腸癌浸潤前沿表現為腫瘤細胞低分化，伴隨上皮表型缺失以及獲得間質表型，從而有利于腫瘤侵襲

4、轉移，這個過程即腫瘤細胞上皮間質轉化(EMT)。結直腸癌上皮間質轉化的一個重要分子是β-連環(huán)素(β-catenin)。β-catenin是一種分子量為90kD多功能蛋白質，它與E-黏附素(E-cadherin)的胞漿端相連構成E-cadherin/β-catenin復合物，參與構成細胞間粘附連接，對于維持上皮的極性和完整性有重要作用；β-catenin又是Wnt信號途徑的下游元件，在Wnt信號的刺激下，β-catenin的磷酸化受到抑制

5、，使胞漿中β-catenin水平升高，β-catenin進入核內，調節(jié)靶基因的表達，當Wnt信號異常激活可引起細胞增殖分化的異常。文獻報道，腫瘤細胞核β-catenin表達變化與結直腸癌肝轉移有關。最近的研究表明，結直腸癌浸潤前沿β-catenin mRNA表達明顯增加，細胞核和細胞漿β-catenin表達亦伴隨增加。上述資料提示，β-catenin在結直腸癌侵襲轉移過程中起重要作用。
　　 基于以往的研究報道，認為結直腸癌浸潤

6、前沿細胞核β-catenin高表達可能在腫瘤浸潤轉移過程中發(fā)揮重要作用。觀察了細胞核β-catenin在結直腸癌浸潤前沿和肝轉移灶的表達，明確二者有無聯系。同時，還研究了結直腸癌浸潤前沿細胞核β-catenin表達與臨床病理特征的關系，明確結直腸癌浸潤前沿細胞核β-catenin表達與同時性肝轉移的關系。
　　 方法:收集486例結直腸癌患者的原發(fā)癌組織和轉移瘤標本以及相關臨床資料，其中包括144例發(fā)生同時性肝轉移患者。采用免疫

7、組織化學法檢測β-catenin在結直腸癌組織和肝轉移灶的表達。采用x2檢驗比較結直腸癌浸潤前沿細胞核β-catenin表達在有肝轉移患者和無肝轉移患者之間的差別；采用spearman相關分析分析結直腸癌浸潤前沿細胞核β-catenin表達與肝轉移灶細胞核β-catenin表達有無關系；x2檢驗分析結直腸癌浸潤前沿細胞核β-catenin表達與臨床病理特征的關系；單因素和logistic多因素回歸分析分析結直腸癌肝轉移的危險因素。

8、>　　 結果:
　　 1.所有結直腸癌患者組織標本中均能觀察到β-catenin表達，在無肝轉移的結直腸癌的浸潤前沿和腫瘤中心β-catenin表達以胞膜型為主；在有肝轉移的結直腸癌的浸潤前沿β-catenin表達以胞核型為主。結直腸癌組織浸潤前沿細胞核β-catenin過表達在有肝轉移的結直腸癌患者較無肝轉移的結直腸癌患者更明顯(71.5％vs.29.3％；P<0.001)。
　　 2.Spearman相關分析顯示發(fā)

9、生結直腸肝轉移的患者結直腸癌浸潤前沿細胞核β-catenin表達與肝轉移灶細胞核β-catenin表達有顯著相關性。
　　 3.x2檢驗結果顯示結直腸癌浸潤前沿細胞核β-catenin表達與年齡(P<0.001)、病理組織類型(P=0.01)、浸潤深度(P<0.001)、淋巴結轉移(P=0.021)、肝轉移(P<0.001)及結直腸癌TNM分期(P<0.001)有關。
　　 4.x2檢驗顯示，結直腸癌同時性肝轉移與年齡(

10、P=0.01)、腫瘤大小(P<0.001)、腫瘤分化程度(P<0.001)、浸潤深度(P<0.001)、淋巴結轉移(P<0.001)及浸潤前沿細胞核β-catenin過表達(P<0.001)有關。
　　 5.Logistic多因素回歸分析提示，年齡(P=0.003)、腫瘤大小(P<0.001)、浸潤深度(P=0.001)、腫瘤分化程度(P=0.031)及浸潤前沿細胞核β-catenin過表達(P<0.001)是結直腸癌肝轉移獨立

11、危險因素。
　　 結論:
　　 1.發(fā)生結直腸同時性肝轉移患者結直腸癌浸潤前沿細胞核β-catenin過表達更為明顯。
　　 2.發(fā)生結直腸肝轉移的患者結直腸癌浸潤前沿細胞核β-catenin表達與肝轉移灶細胞核β-catenin表達呈正相關關系。
　　 3.結直腸癌浸潤前沿細胞核β-catenin表達與年齡、腫瘤病理類型、浸潤深度、淋巴結轉移、肝轉移和TNM分期有關。
　　 4.結直腸癌同時性肝

12、轉移與年齡、腫瘤大小、腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移和浸潤前沿細胞核β-catenin表達有關；年齡、腫瘤大小、腫瘤分化程度、浸潤深度和浸潤前沿細胞核β-catenin過表達是結直腸癌肝轉移的獨立危險因素。
　　 5.結直腸癌浸潤前沿細胞核β-catenin過表達與同時性肝轉移密切相關，細胞核β-catenin過表達可能是一個有價值的預測肝轉移的預測因子。
　　 意義:結直腸癌肝轉移是影響結直腸癌患者預后的重要因素，

13、結直腸癌肝轉移的早期預測及診斷對指導治療，改善患者預后有重要的意義。該研究是基于臨床和病理資料來闡明結直腸癌浸潤前沿細胞核β-catenin過表達與同時性肝轉移關系的研究。本研究的臨床意義在于，發(fā)現結直腸癌浸潤前沿細胞核β-catenin過表達與同時性肝轉移密切相關，提供了一個可能有效預測結直腸癌肝轉移的預測因子。
　　 第二部分 CXCR4/SDF-1信號通路對結腸癌HT29細胞E-cadhor i n/β-catenin復合

14、物表達的影響及其機制研究
　　 研究背景與目的:結直腸癌患者主要的死亡原因是局部復發(fā)和肝臟轉移，人們對結直腸癌肝轉移的機制進行了大量研究。結直腸癌肝轉移的步驟包括腫瘤細胞粘附性能的改變、腫瘤細胞脫離原發(fā)灶并降解細胞外基質、腫瘤細胞局部浸潤及脈管浸潤、腫瘤細胞在循環(huán)中播散和免疫逃逸、腫瘤細胞血管內栓塞、腫瘤細胞在新的微環(huán)境重新生長及腫瘤血管生成等。每一個步驟都涉及多種分子事件，研究這些分子事件有助于理解結直腸癌肝轉移機制，并為結直

15、腸癌肝轉移的預防和治療提供理論依據。
　　 目前對于腫瘤轉移機制的解釋有3種學說，即“種子與土壤”學說、“解剖-機械”學說和“信號或歸巢”學說。“信號或歸巢”學說認為腫瘤細胞高表達特異的趨化因子受體，宿主器官則表達其相應的趨化因子配體，腫瘤細胞借助趨化因子配體與其受體的特異性結合力，實現組織器官的特異性轉移?！靶盘柣驓w巢”學說最初用于解釋造血干細胞特異性歸巢于骨髓，2001年Muller等首次發(fā)現，人乳腺癌組織中和乳腺癌細胞系高

16、表達趨化因子受體CXCR4，而在乳腺癌最常見的轉移部位如淋巴結、肺、肝臟和骨髓等部位則高表達其配體基質衍生因子-1(SDF-1)，并且從這些組織提取的蛋白對乳腺癌細胞有明顯的趨化作用，說明SDF-1及其受體在決定乳腺癌轉移部位上起著非常重要的作用。
　　 SDF-1屬于趨化因子CXC亞家族，CXCR4為G蛋白偶聯的跨膜受體蛋白超家族中的一員，是SDF-1的唯一受體。前已知超過23種人類的惡性腫瘤細胞有CXCR4表達，CXCR4/

17、SDF-1生物軸在乳腺癌、惡性黑色素瘤、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、食管癌等腫瘤侵襲轉移過程中的作用也得到證實。近年來很多研究報道指出趨化因子SDF-1與其特異性受體CXCR4在結直腸癌的肝轉移過程中發(fā)揮重要作用。
　　 E-cadherin是定位于細胞間粘附連接的一次跨膜單鏈糖蛋白，相鄰細胞E-cadherin的胞外域可相互結合形成拉鏈樣結構，介導同型細胞間連接。E-cadherin漿內部分通過α、β、γ-catenin與細胞骨

18、架結合，構成cadherin-catenin復合物，介導細胞粘附和信號轉導，參與調節(jié)組織發(fā)生和形態(tài)分化，對細胞識別、遷移、歸類等行為發(fā)揮重作用。研究表明，E-cadherin/β-catenin復合物與結直腸癌的侵襲轉移關系密切。
　　 前面的研究表明，β-catenin與結直腸癌同時性肝轉移關系密切，基于研究發(fā)現和以往對CXCR4/SDF-1信號通路及E-cadherin/β-catenin復合物與結直腸癌侵襲轉移關系的研究，

19、認為CXCR4/SDF-1信號通路與E-cadherin/β-catenin復合物之間可能存在聯系。本研究檢測了SDF-1對結腸癌HT29細胞系E-cadherin/β-catenin復合物表達的影響。同時，還檢測了E-cadherin/β-catenin mRNA水平的變化及磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)和β-catenin磷酸化變化，探討CXCR4/SDF-1信號通路影響E-cadherin/β-catenin復合物

20、表達可能的分子機制。
　　 方法:
　　 1.MTT法檢測SDF-1對結腸癌HT29細胞增殖的影響。
　　 2.Transwell體外侵襲實驗檢測SDF-1對HT29細胞侵襲能力的影響。
　　 3.免疫細胞化學法檢測SDF-1對HT29細胞E-cadherin和β-catenin表達的影響。
　　 4.反轉錄PCR(RT-PCR)檢測SDF-1對HT29細胞E-cadherin mRNA和β-ca

21、tenin mRNA表達的影響。
　　 5.蛋白免疫印跡法(Western blotting)檢測HT29細胞PI3K/AKT和β-catenin磷酸化變化。
　　 結果:
　　 1.SDF-1作用于HT29細胞48h后，各組增殖并無明顯差異。72h后20ng/mL和40ng/mLSDF-1組HT29細胞增殖較對照組明顯增加，增殖率分別為129％和135％，統計學上有顯著性差異。而預先用AMD3100處理過的HT

22、29細胞，SDF-1促進增殖的作用不明顯，單獨用AMD3100處理的HT29細胞增殖與對照組無差別。
　　 2.SDF-1作用于HT29細胞24h后10ng/mL、20ng/mL和40ng/mL3組遷移細胞較對照組(92.3±12.4)均明顯增加，遷移細胞數分別為149±13.3(P=0.041)，161±13.5(P=0.023)和187.5±14(P(0.001)。預先用AMD3100處理過的HT29細胞侵襲能力無明顯變化，

23、單獨用AMD3100處理的HT29細胞遷移細胞與對照組無差別。
　　 3.免疫細胞化學檢測顯示SDF-1作用48h后，20ng/mL組和40ng/mL組HT29細胞E-cadherin表達較對照組顯著下降。而預先用AMD3100處理過的HT29細胞，SDF-1作用后未見E-cadherin表達下降。單獨用AMD3100處理HT29細胞E-cadherin表達亦未出現明顯變化。
　　 RT-PCR分析顯示，20ng/mL和

24、40ng/mLSDF-1作用HT29細胞48h后，E-cadherin mRNA水平顯著下降。預先用AMD3100處理過的HT29細胞，SDF-1作用后未見E-cadherin mRNA表達下降，單獨用AMD3100處理的HT29細胞E-cadherin mRNA表達亦未出現明顯變化。
　　 4.免疫細胞化學檢測顯示，20ng/mL組和40ng/mL組SDF-1處理48h后HT29細胞的β-catenin表達均顯著下降。盡管預先

25、用AMD3100處理過的HT29細胞經SDF-1作用48h后β-catenin表達亦有所下降，但差異不明顯。單獨用AMD3100處理的HT29細胞β-catenin表達亦未出現明顯變化。
　　 RT-PCR分析顯示，SDF-1作用48h后，20ng/mL組和40ng/mL組HT29細胞β-catenin mRNA水平均顯著下降。預先用AMD3100處理過的HT29細胞SDF-1作用后未見β-catenin mRNA表達下降，單獨

26、用AMD3100處理的HT29細胞β-catenin mRNA水平亦未出現明顯變化。
　　 5.SDF-1(20ng/mL)作用HT29細胞1min后，PI3K/AKT和β-catenin即發(fā)生磷酸化變化，β-catenin磷酸化在第5min時明顯增強，而PI3K/AKT磷酸化則在第15min時明顯增強。β-catenin磷酸化高峰出現在第30min，之后明顯的β-catenin磷酸化一直維持48h；PI3K/AKT磷酸化高峰出

27、現在第15-60min，持續(xù)2h，之后逐漸減弱。分別用0ng/mL，5ng/mL，20ng/mL，40ng/mL和100ng/mL的SDF-1處理HT29細胞30min。結果顯示，PI3K/AKT和β-catenin磷酸化與SDF-1濃度有關，隨著濃度增高，二者磷酸化亦逐漸增強，100ng/mL處理處理HT29細胞30min時PI3K/AKT和β-catenin磷酸化最明顯。
　　 6.應用AMD3100和LY294002分別阻

28、斷CXCR4/SDF-1信號通路和PI3K/AKT信號分子后發(fā)現，AMD3100能夠阻斷HT29細胞PI3K/AKT和β-catenin磷酸化，LY294002也能夠阻斷PI3K/AKT和β-catenin磷酸化。
　　 結論:
　　 1.SDF-1能夠促進人結腸癌HT29細胞的生長；
　　 2.SDF-1能夠增強人結腸癌HT29細胞侵襲能力；
　　 3.CXCR4/SDF-1信號通路參與了誘導HT29細

29、胞E-cadherin/β-catenin復合物表達下降；
　　 4.PI3K/AKT和β-catenin磷酸化及E-cadherin/β-catenin mRNA下調可能是SDF-1誘導HT29細胞E-cadherin/β-catenin下調的重要原因；
　　 5.CXCR4/SDF-1信號通路引起HT29細胞β-catenin磷酸化是通過PI3K/AKT實現的，β-catenin是PI3K/AKT的下游效應因子。