新型手性氮氧自由基對(duì)Alzheimer病的保護(hù)作用研究.pdf

1、目的:
　　阿爾茲海默病(Alzheimer's disease,AD)是老年期癡呆最常見(jiàn)的類(lèi)型。認(rèn)知能力的逐漸下降和淀粉樣斑塊及神經(jīng)原纖維纏結(jié)的出現(xiàn)是其典型的臨床病理特征。最終結(jié)果會(huì)導(dǎo)致腦功能的異常及神經(jīng)元凋亡。隨著我國(guó)人口老齡化的日益嚴(yán)重,AD越來(lái)越成為一個(gè)嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題。研究表明 AD神經(jīng)退行性病變過(guò)程中,氧化應(yīng)激是除年齡外另一個(gè)重要因素。大量的研究表明DNA、RNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化程度在AD病變過(guò)程中不斷升高,直至出現(xiàn)輕

2、度認(rèn)知損傷,這些都說(shuō)明氧化應(yīng)激出現(xiàn)在 AD的早期階段,即發(fā)生在淀粉樣斑塊和神經(jīng)原纖維纏結(jié)之前出現(xiàn)。盡管在 AD的治療研究中有很多針對(duì)于對(duì)抗氧化應(yīng)激介導(dǎo)損傷的神經(jīng)保護(hù)策略,但是臨床結(jié)果積極有效的只有很少一部分。
　　氮氧自由基(Nitroxide radicals, NRs)作為一類(lèi)含有自旋單電子的穩(wěn)定的自由基化合物。早期被用作自旋示蹤劑。近來(lái)研究表明NRs還具有其特殊的生物學(xué)活性,一些NRs具有抗腫瘤、輻射和缺血再灌注損傷等功能。

3、它與有害自由基反應(yīng)通過(guò)“催化劑量”方式進(jìn)行,只需很少的劑量即可發(fā)揮高效、強(qiáng)效和長(zhǎng)效的抗氧化活性。例如,NRs具有擬SOD的作用。它可以通過(guò)電子轉(zhuǎn)移的方式參與到細(xì)胞內(nèi)的線粒體的呼吸鏈?zhǔn)椒磻?yīng),非?？焖俚那宄蹶庪x子自由基 O2.-。正是由于 NRs以催化方式分解不斷產(chǎn)生的有害自由基,反應(yīng)過(guò)程中本身不會(huì)被消耗,可以循環(huán)再生利用,這也是其它自由基清除劑所無(wú)法比擬的。同時(shí)因其特有的自旋示蹤功能,可通過(guò)電子順磁共振或核磁共振成像實(shí)時(shí)了解其在組織中

4、的分布及變化反應(yīng)。
　　正是由于NRs這些獨(dú)特的性質(zhì),我們推測(cè)其在AD的發(fā)病過(guò)程中會(huì)發(fā)揮很好的抗氧化的能力,起到預(yù)防、治療甚至是診斷AD發(fā)生的作用。因此,有望將NRs制備成新型的應(yīng)用于神經(jīng)退行性疾病的抗氧化應(yīng)激損傷的藥物。
　　方法:
　　在本實(shí)驗(yàn)中,我們采用體外抗氧化模型,Aβ1-42誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性損傷模型以及APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD鼠模型,來(lái)評(píng)價(jià)NRs的抗氧化能力及對(duì)AD的保護(hù)作用。
　　體外抗氧化實(shí)驗(yàn)中,

5、我們分別采用光澤精誘導(dǎo)的發(fā)光體系、CHP誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化模型和 F2-異前列素免疫試劑盒來(lái)評(píng)價(jià) NRs清除超氧陰離子和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的能力;
　　體外培養(yǎng)原代皮層神經(jīng)元模型中,在培養(yǎng)到第10天的時(shí)候,分別給予10μM的姜黃素、Tempol和L-NNNBP,孵育24小時(shí)后,用25μM的寡聚態(tài)Aβ1-42處理12小時(shí)。換用原培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后收集細(xì)胞。分別用 CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的存活率;用Tunel試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的凋亡;用

6、3-NT的ELISA試劑盒測(cè)定組織的硝化應(yīng)激水平;用陽(yáng)離子熒光染料-四甲基羅丹明乙酯檢測(cè)線粒體的膜電位變化;用細(xì)胞的免疫熒光觀察激活的Caspase-3的變化;
　　最后采用APP/PS-1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠來(lái)評(píng)價(jià)NRs的自由基清除能力和對(duì)AD的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)分為5組:姜黃素治療組、Tempol治療組、L-NNNBP治療組、WT組和TG組。藥物用飲用水溶解,終濃度均為1mM,WT組和TG組給予正常飲水。在小鼠6周時(shí)給予藥物處理,連續(xù)

7、給藥1個(gè)月。用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)AD小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力;用剛果紅染色方法觀察Aβ斑塊;用蛋白免疫印跡方法觀察磷酸化Tau和GFAP蛋白含量變化;采用免疫組化方法觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活。
　　結(jié)果:
　　體外抗氧化實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)L-NNNBP較姜黃素和Tempol能顯著減少超氧陰離子和脂質(zhì)過(guò)氧化水平(＃P<0.05,＃＃P<0.01)。
　　培養(yǎng)皮層神經(jīng)元模型中,不同劑量的L-NNNBP對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)的細(xì)

8、胞毒性都有保護(hù)作用(*P<0.05,**P<0.01),且是濃度依賴的關(guān)系。單獨(dú)給予 L-NNNBP,沒(méi)有對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。而Tempol的三種劑量都沒(méi)有觀察到神經(jīng)元的保護(hù)作用;姜黃素只有在高劑量(10μM)時(shí)有細(xì)胞保護(hù)作用。Tunel法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)中,相對(duì)于姜黃素(42.9％±3.1%)和Tempol(51.1%±1.1%),L-NNNBP高劑量(10μM)處理組,神經(jīng)元的凋亡顯著降低(22.7%±2.6%,*P<0.05,*

9、*P<0.01,＃＃P<0.01)。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果說(shuō)明L-NNNBP的這種抗凋亡的作用是通過(guò)降低激活型Caspase-3的表達(dá)引起的。Aβ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷也會(huì)造成線粒體功能障礙,影響線粒體正常膜電位,使其去極化。L-NNNBP能顯著降低TMRM+的密度,阻止線粒體膜的去極化,保護(hù)線粒體的正常功能,且其作用強(qiáng)度顯著高于姜黃素和 Tempol(＃P<0.05)。除了氧化應(yīng)激,硝化應(yīng)激也是自由基產(chǎn)生的主要來(lái)源。L-NNNBP三個(gè)濃度都降低

10、了3-NT的含量(**P<0.01),且抑制率顯著高于姜黃素和Tempol(＃P<0.05)。
　　Aβ斑塊的沉積是AD的主要病理癥狀之一。在APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD鼠模型中,6個(gè)月大的APP/PS-1小鼠給予L-NNNBP(1mM)1個(gè)月后,海馬和皮層的Aβ斑塊的沉積都顯著減少,并且效果強(qiáng)于姜黃素和Tempol(＃＃P<0.05)。除了Aβ斑塊沉積, AD的另一個(gè)病理特征就是Tau蛋白異常過(guò)度磷酸化后引起的神經(jīng)原纖維纏結(jié)。AP

11、P/PS1小鼠Tau蛋白的Thr205和Ser235兩個(gè)位點(diǎn)的磷酸化程度顯著升高。相對(duì)于WT組和其它藥物處理組,L-NNNBP顯著的降低了Tau蛋白在兩個(gè)位點(diǎn)的磷酸化程度(**P<0.01,＃P<0.05,＃＃P<0.05)。星形膠質(zhì)細(xì)胞的免疫組化和免疫蛋白印跡結(jié)果說(shuō)明其在 AD發(fā)病的早期就被激活,有可能進(jìn)一步誘導(dǎo)β-淀粉樣蛋白沉積加速和神經(jīng)纖維纏結(jié)形成。而 L-NNNBP在發(fā)揮抗氧化功效的同時(shí)抑制了星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活。Morris水迷

12、宮的行為學(xué)結(jié)果也說(shuō)明APP/PS1小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力受到損傷,在給予 L-NNNBP治療后有顯著改善,并且效果強(qiáng)于姜黃素和 Tempol(**P<0.01,＃＃P<0.01)。
　　結(jié)論:
　　本研究證明,無(wú)論是在氧化損傷的體外模型,還是Aβ1-42誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性損傷模型,或是APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD鼠模型中,新型的手性氮氧自由基L-NNNBP都表現(xiàn)出了令人興奮的結(jié)果。它能清除超氧陰離子、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化、減輕Aβ1-4