老齡小鼠急性心肌梗塞后Wnt及NF-κB信號通路的表達及相互作用與心室重構的關系研究.pdf

1、目的：本研究旨在通過觀察老齡小鼠急性心肌梗塞后Wnt信號通路及核因子（NF）-κB信號通路與低齡小鼠的表達差異，以及心肌梗塞后上述兩條通路的相互作用，以期發(fā)現老齡小鼠心梗后心臟破裂率高、心室重構重的可能機制。本研究包括：1）建立小鼠急性心肌梗塞模型，研究不同年齡小鼠心梗后Wnt信號通路相關蛋白Dishevelled-1（dvl-1），糖原合成激酶（GSK）-3β，β-聯蛋白（β-catenin）及縫隙通道連接蛋白（connexin，cx

2、）43的表達差異。2）研究不同年齡小鼠心肌梗塞后NF-κB活性，及細胞間黏附分子（ICAM）-1,血管黏附分子（VCAM）-1表達差異。3）研究應用二硫代氨基甲酸吡咯烷（PDTC）后對心臟破裂、心室重構及對Wnt信號通路的影響，進一步證實上述兩條通路在心臟破裂、心室重構年齡異質性中所起的作用。
　　 方法：
　　 課題第一部分：1）近交系C57BL 低齡（3月齡Young，Y）和老齡（18月齡Old，O）小鼠各80只，共

3、160只，開胸結扎左冠狀動脈，建立小鼠急性心肌梗塞模型，隨機分為假手術組（sham operation，SH）10只，心梗組（myocardial infarction，MI）70只，觀察小鼠心臟破裂發(fā)生，心肌梗塞面積，左室重構情況，進行不同年齡組的對比研究。2）另選低齡和老齡小鼠各48只，共計96只，根據心梗時間分為SH、心梗（MI）3天、7天、14天組，根據分組在心梗后不同時間處死小鼠留取心臟標本，液氮凍存或甲醛固定備用。3）用we

4、stern-blot法進行不同年齡組左室心肌及梗死區(qū)dvl-1、GSK-3β、β-catenin及cx43表達測定并進行比較，RT-PCR測定dvl-mRNA表達。
　　 課題第二部分：1）近交系C57BL 低齡（3月齡）和老齡（18月齡）小鼠各48只，共96只，建立小鼠急性心肌梗塞模型，隨機分為假手術（SH）組，心梗(MI)3天、7天、14天組，在心梗后不同時間點處死小鼠留取心臟標本，4%多聚甲醛固定或液氮凍存?zhèn)溆?2）應用免

5、疫組化法測定不同年齡小鼠心肌梗塞后p65/p50表達，并進行對比 3）western-blot法測定不同年齡小鼠心肌梗塞后p65/p50，細胞間粘附分子（ICAM）-1和血管粘附分子（VCAM）-1表達。
　　 課題第三部分：1）138只老齡（18個月,O）C57BL小鼠建立急性心肌梗塞模型，69只術后給予PDTC腹腔注射，為PDTC組（pyrrolidine dithiocarbamate，P），其余69只術后給予生理鹽水注射

6、，為心梗組（Myocardial Infarction，M）。2）術后7天進行心臟彩超檢查了解左室重構情況，并檢測兩組的梗死面積，心臟破裂率。3）比較兩組基質金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinases，MMP）-2，9活性，腫瘤壞死因子（TNF）-α mRNA表達及膠原含量探討可能機制。4）測定兩組dvl-1 mRNA、GSK-3β、β-catenin及cx43表達，初步探討兩條通路在心肌梗塞后是否存在相互作用。

7、>　　 結果：1）兩組梗死面積無差異，老齡組小鼠心梗后1周心臟破裂的發(fā)生率顯著升高（35.3vs. 17.7%, p=0.000）。老齡組心室腔擴大和收縮功能障礙更顯著。心梗后左室dvl-1,β-catenin表達高于SH組（P=0.000），說明心梗后Wnt信號通路被激活。老齡與低齡組相比：SH組及MI 14d dvl-1表達差異有統計學意義（P值均為0.000）；β- catenin表達除MI 14d（P=0.003）外余均無差異

8、（P=0.591，0.542）。老齡鼠心梗3天時梗死區(qū)dvl-1及β-catenin表達明顯低于低齡鼠（p=0.000），說明老齡小鼠梗死區(qū)細胞黏附及損傷后修復功能較低齡鼠低。老齡組GSK-3β磷酸化除心梗3天外均較低齡組明顯降低（p=0.000）。低齡組低齡SH組左室心肌cx 43表達是老齡組的2.15倍（P=0.001）。心梗后cx43表達明顯降低（P值分別為0.002和0.000）。心梗3天時老齡組梗死區(qū)cx 43表達低于低齡組（

9、P=0.000），7天時老齡組高于低齡組（P=0.000），14天時老齡組再度低于低齡組（P=0.035），說明老齡鼠梗死區(qū)cx43降低對心肌的保護作用持續(xù)時間短，可能也是老齡鼠心室重構年齡異質性的機制之一。
　　 2）心梗后不同時間，免疫組化顯示老齡組p65，p50陽性細胞數較低齡組高，差異有統計學意義（p65 400 vs 154，p50 179 vs 83，P＜0.05）；western-blot檢測發(fā)現SH組及MI 3d

10、，7d時老齡組p65蛋白表達均高于低齡組，說明老齡小鼠心梗后NF-κB活性較低齡組高。老齡組與低齡組ICAM-1表達差異均無統計學意義；老齡組VCAM-1表達SH組及MI 14d 時較低齡組明顯增加，差異有統計學意義（P值分別為0.001，0.034），說明年齡對VCAM-1表達有影響，但ICAM-1,VCAM-1心梗后表達不存在年齡異質性。
　　 3）用PDTC后心臟破裂率下降（35.3% vs 15.6%，P=0.000），

11、心臟超聲顯示PDTC組與MI組比較左室內徑縮小（P=0.000），室壁厚度增加（P=0.000），左室重量增加（P=0.023），左室短軸縮短率增加（P=0.001）；PDTC組MMP-9，2表達較MI組降低(P=0.023), TNF-αmRNA表達較MI組低（P=0.001）,且PDTC組CVF值較MI組低(P=0.000)，但ICAM-1,VCAM-1表達變化不明顯。抑制NF-κB活性后心臟破裂率下降，且NF-κB相關炎癥因子表達

12、下降，證明NF-κB信號通路在心臟破裂中起了重要作用，且其年齡異質性與心臟破裂的年齡異質性有關，但這種差異與ICAM-1及VCAM-1沒有明確關系。
　　 4）PDTC組dvl-1 mRNA表達低于心梗組（P值均小于0.05）,GSK-3β磷酸化比值均高于心梗組(P值均為0.000)；β- catenin表達PDTC組3天時低于心梗組，7天時高于心梗組(P值均為0.000)；cx 43表達PDTC組明顯低于手術組，差異有統計學意

13、義（P=0.000），抑制NF-κB活性后Wnt信號通路相關蛋白活性發(fā)生變化，說明NF-κB信號通路與Wnt信號通路之間存在“crosstalk”。
　　 結論：1）老齡小鼠心臟破裂率高、心室重構重。心梗后小鼠Wnt信號通路激活，但老齡小鼠梗死區(qū)Wnt信號通路相關dvl-1及β-catenin表達存在年齡異質性， cx43下降對心肌的保護作用持續(xù)時間更短，這可能是老齡小鼠心臟破裂率高、心室重構重的機制。2）心梗后NF-κB信號通

14、路激活，且老齡組NF-κB活性較低齡組高，證實了NF-κB信號通路在急性心肌梗塞時的年齡異質性，但這種年齡異質性不是通過ICAM-1及VCAM-1表達變化實現的。3）NF-κB抑制劑PDTC通過抑制MMP-9，2、TNF-α mRNA表達而降低膠原含量，而降低老齡小鼠心臟破裂率并改善左室重構，進一步證實NF-κB信號通路與心臟破裂及心室重構年齡異質性有關。 4）NF-κB抑制劑PDTC使Wnt信號通路相關蛋白dvl-1 mRNA, cx