豬α干擾素、豬β干擾素與豬γ干擾素的抗病毒活性及其免疫佐劑的研究.pdf

1、干擾素(IFN)是一類具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和增強免疫功能的細胞因子。自1957年Isaaes和Lindenmann首先發(fā)現(xiàn)干擾素(IFN)以來，人們對IFN韻研究、開發(fā)及應用從未停止過，目前IFN已被廣泛應用于人醫(yī)臨床多種疾病的治療。1980年WHO根據(jù)IFN抗原特異性的不同將其分為三類：IFN-α、IFN-β、IFN-γ；后來又依IFN作用的受體不同而分為兩型：Ⅰ型IFN和Ⅱ型IFN，Ⅰ型包括IFN-α、β、w、τ、δ等；Ⅱ型只有I

2、FN-γ。 相對而言，獸醫(yī)界對動物干擾素的研究起步較晚。由病毒、細菌等病原微生物侵染動物所引起的各種傳染性疾病嚴重制約了各個國家和地區(qū)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，同時也對人類健康存在著巨大隱患。因此，研究動物干擾素對動物傳染性疾病的防治措施研究具有重大的經(jīng)濟價值和社會意義。鑒于此，本研究以豬干擾素alpha(PoIFN-α)、豬干擾素beta(PolFN-β)與豬干擾素gamma(PolFN-γ)為研究對象，開展了這三種細胞因子對PRV、

3、PRRSV、FMDV抗病毒活性的研究，及其以蛋白或基因形式對豬瘟疫苗的佐劑效應的研究。主要研究內容包括： 1、PolFN-γ基因的克隆、測序分析及其原核表達 以刀豆素A(ConA)誘導的梅山豬外周血淋巴細胞中提取的總RNA為模板，采用RT-PCR方法克隆擴增出全長豬丫干擾素基因(PoIFNγ，501bp)。經(jīng)測序結果證實擴增得到的PoIFNγ與Genbank上所報道的豬γ干擾素基因同源性為100％；與羊、鹿、駱駝、牛、馬

4、、兔、人、鼠的氨基酸序列同源性分別78％、77％～80％、79％～80％、77％、71％、60％、59％～60％、43％。將PoIFNγ插入pGEX-KG表達載體，并轉化宿主菌BL<,21>，經(jīng)IPTG誘導后，得到高效表達。表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析，證明PoIFN-γ與GST融合表達，主要形成不溶性包涵體，經(jīng)GelExpert軟件分析確定不可溶性融合蛋白約占總蛋白的69.91％，可溶性蛋白占15.64％，大小約為43 kDa。通過

5、對宿主菌不同時間的誘導發(fā)現(xiàn)目的蛋白在誘導后5小時的表達量最高，可達0.86 mg/mL。將表達產(chǎn)物變性、復性、透析、純化處理后加入牛腎細胞 (MDBK) 上，用水泡性口炎病毒(VSV)攻毒，測出重組的PoIFNγ具有較高的抗病毒作用，生物活性達到1.0×10<'5>U/mg。 2、PoIFN-α、PoIFN-β和PoIFN-γ的酵母分泌表達及PoIFN-β對FMDV的抑制作用 為了獲得高效分泌表達的重組豬α、β、γ干擾素

6、，利用基因工程技術，分別將編碼梅山豬α、β、γ干擾素成熟蛋白基因(mPoIFNα/β/γ，501/498/435 bp)，亞克隆到含分泌信號肽序列的畢赤酵母表達載體pPIC 9K中，構建成分泌型重組表達載體pPIC 9K-mPoIFNα/β/γ。用化學方法(LiCl)，將線性化的mPoIFNα/β/γ與ssDNA共轉化入畢赤酵母菌株GS115，轉化子經(jīng)MD平板篩選租PCR鑒定后，得到的陽性菌株再以高濃度的G418篩選到多拷貝重組子。該高

7、拷貝菌株經(jīng)1％甲醇連續(xù)誘導4天，表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western blot檢測，結果表明在畢赤酵母中豬α、β、γ干擾素獲得分泌型表達，對表達產(chǎn)物進行理化分析及細胞病變抑制法(CPE<,50>)測定結果表明，表達產(chǎn)物具有較高的抗病毒生物活性。此外，酵母表達的PoIFN-β對口蹄疫病毒在IBRS-2細胞中的增殖也有明顯的抑制作用。 3、豬α、β、γ干擾素在不同細胞系中的表達及其單獨或聯(lián)合作用對PRV增殖的抑制效果的比較

8、 分別構建3種真核表達質粒：pcDNA-PoIFNα(pcD-PoIFNα)、pcDNA-PoIFNβ(pcD-PoIFNβ)與pcDNA-PoIFNγ(pcD-PoIFNγ)，分別轉染HeLa、MDBK、BHK-21、PK-15及IBRS-2細胞。于轉染后6、24、48、72小時檢測轉染細胞上清中的抗病毒活性(MDBK/VSV)。結果發(fā)現(xiàn)，在五種細胞中干擾素的表達量均在轉染后48小時達到高峰。轉染了pcD-PoIFNα的PK-15

9、，IBRS-2和BHK-21細胞是同樣轉染的MDBK和HeLa細胞中表達的PoIFNα的活性的256～890倍；而轉染了pcD-PoIFNβ的IBRS-2和BHK-21細胞比同樣轉染的PK-15和HeLa細胞中表達的PoIFNβ的活性高2.2～6倍，后兩種細胞又比MDBK細胞轉染后表達PoIFNβ的活性高10～14倍。對于五種轉染pcD-PoIFNγ的細胞，在PK-15、IBRS-2、BHK-21和MDBK之間沒有顯著差異。 在

10、本研究中還比較了豬α、β、γ干擾素、及其兩兩聯(lián)合預處理IBRS-2細胞后對PRV增殖的抑制作用。結果發(fā)現(xiàn)在三種干擾素中 PoIFN-β能最有效的抵制PRV的增殖——100U/mL PoIFN-β就能使PRV空斑數(shù)目減少5.3倍；PoIFN-γ則能抑制PoIFN-γ達3.3倍；而PoIFN-α僅能抑制空斑數(shù)目1.26倍，且即使將其濃度上調至12800U/mL 其抑制倍數(shù)也僅提高至2.3倍。當PoIFN-γ與PoIFN-α或PoIFN-β聯(lián)

11、合作用時其抑制PRV 空斑數(shù)目分別達到12.8倍和100倍。而PoIFN-α或PoIFN-β與PoIFN-γ聯(lián)合作用時也可有效抑制PRV復制達29和146倍。此外，實時定量PCR結果也顯示了當PoIFN-γ與PoIFN-α或PoIFN-β聯(lián)合刺激IBRS-2細胞時，PRV的立即早期基因mRNA比對照細胞減少23.8或133.0倍。實驗結果均表明PoIFN-γ能與PoIFN-α或PoIFN-β在體外產(chǎn)生協(xié)同抗PRV作用。 4、重組

12、腺病毒介導的豬α、β、γ干擾素的表達及rAd-PoIFNα抗PRRSV作用 分別將豬α/β干擾素(PoIFN α/β/γ)基因插入腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV，構建成重組質粒pSh-PoIFNα/β/γ。將此重組質粒經(jīng)Pine Ⅰ線性化和去磷酸化后回收，與腺病毒骨架載體pAdEasy-1共同電轉化BJ5183感受態(tài)細胞，在Kan平板上37℃培養(yǎng)24h，挑選較小的菌落，提取的重組質粒經(jīng)Pac Ⅰ鑒定正確的陽性克隆命名為p

13、Ad-Sh-PoIFNα/β/γ，轉化XL10-Gold 感受態(tài)后大量制備。pAd-Sh-PoIFNα/β/γ以PacⅠ線性化后回收，用脂質體轉染法轉染293A包裝細胞系，轉染7～10天出現(xiàn)典型的細胞病變，說明重組了豬α/β/γ-干擾素的腺病毒基因組(缺失E1和E3基因)在其包裝細胞系中成功包裝成完整的病毒粒子。將此重組后的腺病毒連續(xù)接種傳代，每代提取病毒基因組，PCR均能擴增出目的片段，證明該種表達豬α/β/γ-干擾素的重組腺病毒能穩(wěn)

14、定傳代。利用細胞病變抑制法，收取病變后293A細胞上清，在牛腎細胞(MDBK)上進行干擾素抗病毒活性檢測，結果顯示豬α/β/γ干擾素的抗病毒(VSV)活性分別達83640320U/mL、5242880U/mL、1310720U/mL，說明重組腺病毒成功轉導豬干擾素基因，并表達出具有良好生物學活性的豬干擾素。分別以由腺病毒介導的100U/mL，400U/mL 和327680U/mL PoIFN-α預處理MARC-145細胞，同時設空白腺病

15、毒對照。20小時后，感染不同TCID<,50>的PRRSV，逐日觀察細胞病變，結果發(fā)現(xiàn)，高劑量的PoIFN-α能有效抑制細胞病變且呈一定的劑量相關及時間相關關系。此外，實時定量PCR結果也表明即使是低劑量的PoIFN-α也能抑制PRRSV的ORF7和Nsp9基因的表達。該實驗結果預示rAd-PoIFNα能有效抑制PRRSV在體外的增殖并有望應用于臨床對PRRSV的防制。 5、豬α、γ干擾素增強CSFV細胞苗(c-strain)在

16、豬體內的IgG及l(fā)gG2的抗體水平并調節(jié)Th1免疫反應 分別將表達的豬α、γ干擾素蛋白(1×10<'6>U、2×10<'5>U、5×10<'4>U/頭份)或豬α、γ干擾素真核質粒(400μg/頭份)與CSFV細胞苗(c-strain)聯(lián)合免疫仔豬。結果發(fā)現(xiàn)，二免后聯(lián)合免疫2×10<'5>U/頭份或5×10<'4>U/頭份重組蛋白豬α干擾素或三種劑量的豬γ干擾素與單獨免疫細胞苗的對照組相比能顯著提高特異性 IgG的滴度。而在首免后

17、，聯(lián)合免疫10<'6>U/頭份豬α干擾素或任一劑量的豬γ干擾素能比細胞苗對照組或聯(lián)合免疫pcD-PoIFNγ/顯著提高特異性IgG2的滴度。此外，它們還能將IgG2/IgG1的比率向Th1免疫方向調節(jié)，尤其是在聯(lián)合免疫2×10<'5>U/頭份豬γ干擾素的試驗組。試驗結果表明，豬γ干擾素比豬α干擾素具有更強的免疫調節(jié)能力，它能有效地提高IgG、IgG1、IgG2的抗體滴度并將免疫反應調向Th1。此外，研究也表明，干擾素蛋白比真核質粒介導的