中華鱉IL-1β和TLR4基因的鑒定及芽孢桿菌影響中華鱉免疫功能的初步研究.pdf

1、中華鱉（Pelodiscus sinensis）屬于爬蟲(chóng)綱龜鱉目，是古老的次水生爬行動(dòng)物，作為變溫羊膜腔動(dòng)物，是變溫?zé)o羊膜動(dòng)物到恒溫羊膜腔動(dòng)物進(jìn)化的聯(lián)接點(diǎn)，對(duì)于系統(tǒng)發(fā)育學(xué)的研究有較高的科研價(jià)值。同時(shí)，中華鱉作為一種高營(yíng)養(yǎng)，高經(jīng)濟(jì)附加值的水產(chǎn)品，在東南亞地區(qū)、特別是中國(guó)，其養(yǎng)殖規(guī)模逐年擴(kuò)大，疫病也呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)。由于對(duì)中華鱉及其病原學(xué)的基礎(chǔ)研究相對(duì)滯后，疫病防控的措施也相對(duì)缺乏，在中華鱉養(yǎng)殖中也曾出現(xiàn)了抗生素和違禁藥物濫用亂用等現(xiàn)象，

2、導(dǎo)致藥物殘留等安全問(wèn)題。本研究通過(guò)對(duì)IL-1β與TLR4基因的克隆研究，旨在探明它們與其他脊椎動(dòng)物之間的差異，為中華鱉疾病防控，生理狀態(tài)監(jiān)控等提供研究基礎(chǔ)和依據(jù)。同時(shí)探討了枯草芽孢桿菌對(duì)于中華鱉免疫相關(guān)基因、腸道菌群以及生產(chǎn)性能的影響。
　　1.中華鱉IL-1β的基因克隆，功能鑒定以及成熟肽切割位點(diǎn)的確定
　　克隆和鑒別了中華鱉IL-1β分子(tIL-1)。序列分析結(jié)果表明，tIL-1β的cNDA全長(zhǎng)1529 bp，包含一個(gè)

3、61 bp的5'UTR，831 bp，編碼277個(gè)氨基酸的ORF和637bp的3'UTR， tIL-1β mRNA的3'UTR的GC含量高于已知的IL-1β。tIL-1β含有IL-1家族特征序列，結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，tIL-1β的C端為一個(gè)由12個(gè)β折疊組成IL-1特征結(jié)構(gòu)—β三葉草(β-trefoil)結(jié)構(gòu);同源性分析表明，tIL-1β與來(lái)自鳥(niǎo)類(lèi)的IL-1β最為接近，核苷酸和氨基酸序列的同源性分別為為46.7％和58.4％。中華鱉人工感染嗜

4、水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)后，tIL-1β的mRNA轉(zhuǎn)錄水平在不同組織內(nèi)均有上升，脾臟中表達(dá)量最高，在感染后6h提高20倍。通過(guò)在HEK293細(xì)胞中共表達(dá)tIL-1β和tcaspase-1，缺少經(jīng)典的哺乳動(dòng)物特有的ICE(Interleukin-1β cut enzyme)位點(diǎn)的tIL-1β能夠被tcaspase-1切割。對(duì)可能切割的天冬氨酸位點(diǎn)進(jìn)行突變，確認(rèn)D130為tIL-1β的ICE位點(diǎn)。通過(guò)桿狀病毒表

5、達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的tIL-1β成熟肽刺激中華鱉外周血單核/巨噬細(xì)胞(PBMo)可提高tIL-1β、COX-2等炎癥相關(guān)基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，說(shuō)明tIL-1β具有類(lèi)似哺乳動(dòng)物的生物學(xué)功能。
　　2.中華鱉Toll樣受體4的克隆和功能鑒定
　　TLR4是Toll樣受體家族成員之一，能夠識(shí)別革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁上的脂多糖成分(Lipopolysaccharide，LPS)，并通過(guò)MyD88依賴(lài)和MyD88非依賴(lài)信號(hào)通路，誘導(dǎo)炎癥相關(guān)蛋白

6、和干擾素的產(chǎn)生。研究克隆并鑒定了來(lái)自中華鱉的TLR4分子(tTLR4)的cDNA全長(zhǎng)序列，tTLR4全長(zhǎng)3396bp，ORF長(zhǎng)為2502 bp，編碼一個(gè)833個(gè)氨基酸的蛋白。在蛋白質(zhì)組成結(jié)構(gòu)上，由3個(gè)部分組成，分別為亮氨酸重復(fù)序列(Leucine-rich repeat，LRR)和亮氨酸重復(fù)序列C端(LRRCT)組成的胞外區(qū)域，Ⅰ型跨膜結(jié)構(gòu)域以及胞內(nèi)的TIR(Toll-IL-1 receptor domain)結(jié)構(gòu)域。通過(guò)與其他脊椎動(dòng)物

7、TLR4基因的氨基酸和核苷酸序列相似度比較，以及基因組的鄰近基因組成分析顯示，tTLR4與哺乳動(dòng)物，禽類(lèi)的TLR4較為接近。嗜水氣單胞菌感染后中華鱉的血液和脾臟中的tTLR4 mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著上升。PBMo經(jīng)100 ng/ml的LPS刺激后，細(xì)胞中IL-1β，COX-2，以及tTLR4基因的mRNA水平顯著上升。構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)tTLR4的HEK293細(xì)胞經(jīng)不同濃度的LPS刺激后，通過(guò)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，tTLR4可激活NF-κB

8、啟動(dòng)子，但不能激活I(lǐng)FN-β啟動(dòng)子。研究結(jié)果顯示，tTLR4是哺乳動(dòng)物和禽類(lèi)TLR4的直系同源基因，具有與哺乳動(dòng)物類(lèi)似的生物學(xué)功能，并能通過(guò)MyD88-依賴(lài)途徑啟動(dòng)中華鱉機(jī)體的免疫反應(yīng)。
　　3.枯草芽孢桿菌對(duì)中華鱉腸道菌群，消化酶活以及免疫相關(guān)基因的影響
　　研究了本實(shí)驗(yàn)室篩選得到的一株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）對(duì)中華鱉生產(chǎn)性能，腸道微生態(tài)以及部分免疫相關(guān)基因的表達(dá)影響。中華鱉作為非模式動(dòng)物，缺少各

9、類(lèi)模式相關(guān)(pattern recognition receptor，PRR)受體序列信息，借助于外周血轉(zhuǎn)錄組的De novo拼接得到的轉(zhuǎn)錄本，獲得了12條Toll樣受體基因(TLR)。飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加枯草芽孢桿菌能夠顯著提高中華鱉體重，降低飼料轉(zhuǎn)化率，提高腸道內(nèi)的消化酶酶活。利用454測(cè)序?qū)δc道菌群進(jìn)行分析表明，中華鱉腸道的中厚壁菌門(mén)為主要優(yōu)勢(shì)菌群，而枯草芽孢桿菌處理后，厚壁菌的比例進(jìn)一步增加，并且擬桿菌，變形門(mén)菌等革蘭氏