一類新非編碼RNA的發(fā)現(xiàn)以及產(chǎn)生和功能的初探.pdf

1、非編碼RNA通過不同的路徑來調(diào)控基因表達，它與許多生理活動和疾病有關(guān)。而環(huán)RNA作為非編碼RNA的一種，30多年前就被發(fā)現(xiàn)了，但是人們當時只是把它當作一類轉(zhuǎn)錄本在發(fā)生錯誤剪接和拼接過程中形式的垃圾RNA分子。直到2013年人們才認識到環(huán)狀RNA在哺乳動物細胞中是普遍存在的，其中有一類環(huán)RNA序列當中充滿了小RNA的結(jié)合位點，可起到“海綿”的作用，能夠在每個環(huán)RNA分子上結(jié)合大量的小RNA。已有的研究表明環(huán)狀RNA在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中扮演著一個

2、重要角色，環(huán)RNA已成為目前分子生物學領(lǐng)域的國際熱點課題之一。本文正是在已有的關(guān)于環(huán)RNA研究的基礎(chǔ)上，從實驗上對環(huán)RNA進行了深入和細致的研究，取得了以下重要的成果:
　　(1)在研究與調(diào)控polⅡ轉(zhuǎn)錄的非編碼RNA實驗中，發(fā)現(xiàn)一類新的環(huán)RNA。選取其中15個進行實驗驗證。這類環(huán)RNA是不同于之前研究人員發(fā)現(xiàn)的。它是由外顯子-內(nèi)含子-外顯子構(gòu)成的，而連接部分必須是由兩個外顯子連接在一起的，中間是由內(nèi)含子構(gòu)成的。這類環(huán)RNA在不同

3、細胞中表現(xiàn)出組織特異性。例如，CLTCmRNA在兩種細胞中都有表達，但是circCLTC只在HeLa細胞中表達，而在HEK293細胞中是不表達。同時，我們檢測了其中兩個CircEIF3J和CircPAIP2在HeLa細胞中的拷貝數(shù)，分別大約為31個和22個。
　　(2)對比這15個circular RNA的前后序列，發(fā)現(xiàn)其中有4個是有前后互補的Alu序列，還有4個雖然不是Alu序列，但是前后也有堿基互補的序列。通過構(gòu)建circEI

4、F3J和circPAIP2的四種不同目的片段的環(huán)RNA質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后來檢測這兩個環(huán)RNA在細胞和細胞核中的表達量，發(fā)現(xiàn)如果環(huán)RNA前后的互補序列越多，產(chǎn)生的circular RNA也越多，可能是這樣很容易構(gòu)成一個發(fā)卡結(jié)構(gòu)，便于環(huán)RNA的剪切。但是我們卻發(fā)現(xiàn)這些人工構(gòu)建的circular RNA不會對它們parent基因的表達產(chǎn)生影響。
　　(3) Alu元件作為為哺乳類動物所特有的的短散在元件，可能在對環(huán)RNA的產(chǎn)生過程當中起到非常

5、重要的作用。所以，構(gòu)建了一類全新環(huán)RNA質(zhì)粒，在人類細胞中是不可能自然產(chǎn)生的。通過實驗可以發(fā)現(xiàn)這四個質(zhì)粒也能夠產(chǎn)生環(huán)RNA的，但是跑膠的目的條帶卻是彌散的，推測是產(chǎn)生環(huán)RNA時剪切位點不同。
　　(4)通過觀察發(fā)現(xiàn)這類環(huán)RNA的銜接位點兩端處都有AG-GT序列，這個序列是否對環(huán)RNA的產(chǎn)生或功能有影響了？構(gòu)建了兩批不同的質(zhì)粒，一類是以GFP為報告基因的，一類是熒光素酶為報告基因的。通過實驗發(fā)現(xiàn)，AG-GT序列對環(huán)RNA的產(chǎn)生沒有影