家蠶桿狀病毒bm64基因功能研究.pdf

1、家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus，BmNPV)屬于桿狀病毒科核型多角體病毒屬。家蠶核型多角體病毒（以下簡(jiǎn)稱(chēng)家蠶桿狀病毒）是感染家蠶的重要病原體，我國(guó)家蠶養(yǎng)殖業(yè)每年因此遭受巨大經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)于家蠶桿狀病毒基因功能的探索是近些年來(lái)研究熱點(diǎn)之一，但是依然存在很多功能未知的基因。
　　本研究就家蠶桿狀病毒的功能未知基因bm64開(kāi)展研究。通過(guò)對(duì)NCBI上發(fā)布的BmNPV（T3株）全序列(Ge

2、nBank No.L33180.1)，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，尋找bm64基因序列并進(jìn)行比對(duì)和結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)。結(jié)果表明bm64與AcMNPV同源序列的同源性高達(dá)95％，Bm64蛋白含有一段疏水結(jié)構(gòu)域(62～84 aa)。通過(guò)構(gòu)建pGEX-4T-3-bm64，轉(zhuǎn)化至Rosetta菌株，誘導(dǎo)表達(dá)Bm64蛋白，親和純化該蛋白作為抗原免疫新西蘭大白兔，獲得多克隆抗體。使用該抗體成功檢測(cè)到BmNPV感染BmN細(xì)胞后產(chǎn)生Bm64蛋白。通過(guò)間接免疫熒光檢測(cè)發(fā)

3、現(xiàn)BmNPV感染細(xì)胞后Bm64蛋白主要定位于細(xì)胞核內(nèi)。因此，推測(cè)bm64基因可能在病毒DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程中起一定的作用。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)該基因的轉(zhuǎn)錄時(shí)相進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)bm64基因的轉(zhuǎn)錄時(shí)相與晚期基因vp39相似，推測(cè)該基因?yàn)橥砥诨?。為闡明bm64基因功能，利用Red同源重組系統(tǒng)和Bacmid桿粒構(gòu)建bm64缺失型重組桿狀病毒，探索其基因缺失對(duì)病毒復(fù)制的影響。通過(guò)Bac-to-Bac系統(tǒng)將bm64基因及其啟動(dòng)子進(jìn)行異位補(bǔ)回，構(gòu)建基

4、因回復(fù)的重組桿粒。將egfp與ph基因通過(guò)Bac-to-Bac系統(tǒng)重組入Bacmid中，構(gòu)建三種不同Bacmid(Bacmid-egfp-ph、Bacmid-△bm64-egfp-ph、Bacmid-bm64rep-egfp-ph)。Western Blot驗(yàn)證基因缺失重組病毒不表達(dá)Bm64蛋白。將三種桿粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)bm64基因缺失后重組病毒導(dǎo)致細(xì)胞病變的時(shí)間明顯延遲，而TCID50檢測(cè)也表明病毒滴度下降，而基因補(bǔ)回的重組病毒感染細(xì)

5、胞后的病毒滴度達(dá)到野生病毒水平。因而，推測(cè)bm64基因是病毒復(fù)制的非必需基因，但是bm64基因在病毒復(fù)制感染中起重要作用。Real-time PCR檢測(cè)顯示bm64缺失的重組桿狀病毒的早、晚、極晚期基因lef-3、vp39、p10轉(zhuǎn)錄水平均有不同程度的降低。
　　本研究對(duì)bm64基因的轉(zhuǎn)錄時(shí)相、原核表達(dá)和亞細(xì)胞定位等方面進(jìn)行研究，通過(guò)對(duì)基因缺失的重組桿狀病毒進(jìn)行病毒滴度、病毒DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)檢測(cè)，推測(cè)bm64基因能影響病