寬體金線蛭抗凝物質的分離純化及理化性質研究.pdf

1、水蛭始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,歷代本草均有記述。中醫(yī)認為水蛭具有破血、逐瘀、通經(jīng)之功能。近年來,它的醫(yī)用研究越來越廣泛,特別是水蛭中提取的抗凝物質,目前研究最多的是水蛭素。中國藥典(2000版)收錄的三個水蛭品種中,寬體金線蛭(Whitmania pigraWhitman)使用最廣泛,并且在我國廣泛養(yǎng)殖,另外兩個品種:日本醫(yī)蛭、柳葉金線蛭在我國養(yǎng)殖數(shù)量很少,現(xiàn)在藥廠使用的多數(shù)是寬體金線蛭。而關于寬體金線蛭活性成分國內報道研究的很少,關于寬體

2、金線蛭中抗凝物質的序列更是沒有報道。為了進一步探討其抗凝作用的物質,本試驗采用寬體金線蛭作為實驗材料,對其含有的抗凝物質進行分離純化并進行序列測定。
　　 本研究首先采用寬體金線蛭的鮮品與干品作為實驗材料,用丙酮.三氯乙酸法和三氯乙酸法進行粗提。結果表明：采用干品寬體金線蛭作為粗提材料,丙酮.三氯乙酸法作為提取方法時,每克材料所得的粗品質量0.394g,所得粗品比活力1.961IU3/mg。與采用干品作為實驗材料,三氯乙酸法作為

3、實驗方法相比,每克材料所得到粗品質量與比活力均比后者要高；當用鮮品作為實驗材料時,無論采用哪種方法,所得粗品質量及比活均小于以干品作為實驗材料的質量及比活。因此本試驗采用干品寬體金線蛭作為實驗材料,丙酮.三氯乙酸法作為粗提方法。為分離得到單一蛋白質并對提取方法進行優(yōu)化,本試驗采用不同柱填料進行分離。采用Sephadex G-50時總活力回收率是52.174％,純化倍數(shù)18.390;采用Sephadex G-75時總活力回收率是59.62

4、7％,純化倍數(shù)8.294。在總活力回收率與吸收峰相近情況下,Sephadex G-50純化倍數(shù)要高于Sephadex G-75,因此我們采用Sephadex G-50作為凝膠過濾層析柱填料。對凝膠過濾層析得到的抗凝物質進行離子交換分離并且對不同柱填料進行比較,結果表明:兩種不同柱填料DEAE—Separose CL-6B和DEAE-cellulose DE-52相比,DEAE-Separose CL-6B回收率與純化倍數(shù)(88.71％,

5、1.36)均大于DEAE-cellulose DE-52(68.98％,1.117),并且DEAE-Separose CL-6B分離后電泳結果顯示只有兩個蛋白質條帶,DEAE-celluiose DE-52有三條蛋白條帶,因此采用DEAE-Separose CL-6B作為離子交換層析的柱填料。將陰離子交換得到的抗凝物質進行Sep-pak C18柱分離,經(jīng)過SDS-PAGE電泳結果顯示,只有單一條帶,說明分離得到的抗凝物質是電泳純的單一肽

6、鏈,分子量大約為14.9KD。對所得抗凝物質進行雙向電泳,只得到一個電泳斑點,初步推算其等電點.5.9。最后將所得的抗凝物質PVDF轉膜,N端序列測定。根據(jù)等電點、分子量及測序結果分析,我們提取得到的抗凝物質是一種新的蛋白質。對分離得到的抗凝物質進行理化性質分析,結果表明分離純化得到的抗凝物質是一種非常穩(wěn)定的蛋白質。溫度升高(100℃水浴)和pH(1—13)的改變不影響其活力。在某些變性劑(1％SDS、0.1mol/l DTT。和25％