家蠶微孢子蟲侵染相關表面蛋白SP84的分離、純化及鑒定.pdf

1、微孢子蟲是一種專性細胞內(nèi)寄生的原生動物,能感染從原生動物到哺乳動物,包括昆蟲、魚類和人類在內(nèi)的幾乎所有的動物,同時又是很有前途的生防制劑。微孢子蟲以孢子發(fā)芽的方式侵染宿主細胞,孢子發(fā)芽是侵染的先決條件,微孢子蟲表面蛋白又與孢子發(fā)芽以及侵染有關。因此,對微孢子蟲侵染相關表面蛋白的研究,對微孢子蟲防治和利用具有重要的意義。本論文基于目前對微孢子蟲表面蛋白和有關病原微生物侵染宿主細胞的機制等方面的研究成果,通過制備特異識別家蠶微孢子蟲(Nos

2、ema bombycis,Nb)表面蛋白的單克隆抗體(monoclonal antibody,Mab),研究了單抗對Nb孢子體外發(fā)芽以及入侵家蠶細胞(Bombyx mori cell,BmN)的影響,發(fā)現(xiàn)了一種和Nb孢子體外發(fā)芽以及侵染有關的孢子表面蛋白SP84,并對其進行了分離和鑒定,為解明微孢子蟲的侵染機制提供了重要依據(jù)。
　　 1.制備了特異識別Nb孢子表面蛋白的單克隆抗體。 通過Nb孢子的動物免疫、細胞融合、篩選、克隆和

3、腹水制備,成功制備了7株(1A6、3B1、3C1、3C2、3C3、3C4和3F1)特異識別Nb孢子表面蛋白的單克隆抗體。將制備的7株單克隆抗體分別與成熟Nb孢子、未成熟Nb孢子、成熟內(nèi)網(wǎng)蟲屬樣小孢子(Endoreticulatus-like microsporadium,簡稱Esp)和未成熟Esp孢子反應,發(fā)現(xiàn)7株單抗和成熟Nb孢子以及未成熟Nb孢子均發(fā)生反應,其中單抗1A6還和兩種Esp孢子具有免疫交叉反應,可利用單抗將Nb孢子和在生

4、產(chǎn)上影響不大的內(nèi)網(wǎng)蟲屬樣小孢子準確區(qū)分。本研究制備的單克隆抗體效價較高,特異性較好,既可以用來篩選微孢子蟲侵染相關表面蛋白,也可有效地用于養(yǎng)蠶生產(chǎn)上的Nb孢子的檢測。
　　 2.單克隆抗體預處理Nb孢子可以使孢子的體外發(fā)芽率顯著降低。 單抗預處理Nb孢子后,用分光光度計法調(diào)查了孢子在發(fā)芽培養(yǎng)基中的發(fā)芽情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),單抗3C2、1A6及3C4對Nb孢子體外發(fā)芽均有顯著的抑制作用(p0.05),而其中以3C2效果最為顯著,對Nb孢

5、子體外發(fā)芽相對抑制率達到26.4％,而其他單抗對Nb孢子的體外發(fā)芽未見有顯著的影響(p0.05)。
　　 3.單克隆抗體可以降低Nb孢子對BmN細胞的感染率。 選取對Nb孢子體外發(fā)芽抑制能力最強的單抗3C2,將其預處理Nb孢子后,接種BmN細胞,觀察Nb孢子對細胞的侵染情況,結(jié)合DAPI活體熒光染色法對Nb孢子侵染、增殖的整個過程進行了觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn),Nb孢子經(jīng)1mg／mL的單抗3C2預處理以后,與對照組相比,受感染BmN細胞的

6、比率明顯下降。從接種12h后開始觀察,到96h后孢子感染的細胞破潰,試驗組受感染細胞數(shù)明顯低于對照組。接種后72 h觀察發(fā)現(xiàn),此時受感染BmN細胞比率差別最大,經(jīng)單抗3C2預處理的試驗組,受感染細胞的百分比僅為9.1％,而對照組卻達到了57.7％,兩者差了48.6個百分點。單抗3C2和Nb孢子以及細胞的共培養(yǎng)還顯示,3C2對Nb孢子感染BmN細胞還具有長期影響,接種72 h后,預處理組單抗對Nb孢子感染BmN細胞的影響顯著下降,而相對而

7、言,共培養(yǎng)組直到接種96 h后,仍然對Nb孢子感染BmN細胞有顯著的影響。
　　 4.通過SDS-PAGE、固相2D-PAGE技術以及Western-blotting對單抗3C2識別的Nb孢子表面蛋白進行分子量和等電點的分析,并將其純化出來。SDS-PAGE顯示Nb孢子表面蛋白圖譜有11條蛋白帶清晰可見：84 kDa、59 kDa、55 kDa、46 kDa、37 kDa、34 kDa、31 kDa、26 kDa、17 kDa、

8、14 kDa和12 kDa。單抗3C2識別的蛋白大小約為84 kDa左右。Nb孢子表面蛋白的2D圖譜顯示,上樣蛋白量為120μg時,Nb孢子表面蛋白約有160多個,Nb孢子的主要蛋白以中性偏酸性小分子(18 kDa,pI 5.4～pI 7.2)居多。單抗3C2識別的抗原蛋白(an 84 kDa surface protein,命名為SP84)分子量約為84 kDa,pI為7.2,從2D膠上看,屬于蛋白豐度較低蛋白。
　　 5.間

9、接免疫熒光反應(IFAT)以及免疫膠體金試驗顯示SP84定位在Nb孢子表面。 單抗3C2的IFAT檢測到Nb孢子表面具明亮的翠綠色熒光,孢子經(jīng)SDS處理后和單抗反應則檢測不到熒光。免疫膠體金試驗還可以看出抗原分布相對較為分散,呈彌漫性分布,對照組則未見有金顆粒結(jié)合于孢子外孢壁。
　　 6.免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation, Co-IP)結(jié)果顯示SP84可能和其孢內(nèi)或孢外蛋白P34存在蛋白質(zhì)間相互作用。