肌球蛋白輕鏈激酶CaM結合位點突變體的構建、表達及功能研究.pdf

1、本實驗利用牛胃重組全長野生型MLCK，對其1002-1022氨基酸(即CaM結合位點)進行定點突變，使牛胃MLCK cDNA序列中的T3016、G3017、A3052、G3053、A3054、C3055、T3056 突變?yōu)镚3016、C3017、G3052、C3053、G3054、G3055、C3056，在氨基酸水平上Trp1006、Arg1018、Leu1019將被突變?yōu)锳la。并利用大腸桿菌表達系統(tǒng)成功地進行了大量表達，經(jīng)純化獲得了

2、重組的MLCK突變體。檢測了重組MLCK突變體對肌球蛋白的Mg2+-ATP酶活性的影響、MLCK突變體與肌動蛋白的結合的活性以及對體外肌絲運動的影響，進一步證明了MLCK的非激酶活性在平滑肌收縮過程中的調(diào)節(jié)作用。 方法：根據(jù)牛胃重組全長野生型MLCK的cDNA序列設計兩條突變引物，通過PCR反應進行定點突變。在大腸桿菌中表達重組全長野生型MLCK(WT/MLCK)和CaM結合位點突變型MLCK(△CaM/MLCK)，通過親和層析

3、及凝膠過濾進行分離純化。SDS-PAGE檢測表達及純化的重組蛋白。Glycerol-PAGE檢測重組MLCK對MLC20的磷酸化水平?？兹妇G方法檢測重組MLCK突變體對肌球蛋白的Mg2+-ATP酶活性的影響。蛋白結合實驗檢測Ca2+/CaM對重組MLCK與肌動蛋白結合活性的影響。體外肌絲運動實驗(in vitro motility assay)檢測重組MLCK對肌動蛋白肌絲運動速度的影響。 結論：本實驗得到如下結論：1.通過定點

4、突變獲得重組MLCK鈣調(diào)蛋白結合位點突變體(△CaM/MLCK)并可以在大腸桿菌中以可溶形式大量表達；經(jīng)親和層析和凝膠過濾獲得較純的重組MLCK。2.△CaM/MLCK失去了磷酸化肌球蛋白20KD調(diào)節(jié)輕鏈的激酶活性。3.通過重組突變型MLCK(△CaM/MLCK)對肌球蛋白Mg2+-ATP酶活性的影響表明MLCK具有非激酶活性。在無Ca2+/CaM條件下，激活非磷酸化肌球蛋白的Mg2+-ATP酶活性；抑制磷酸化肌球蛋白的Mg2+-ATP