miR-146a在脂多糖誘導的大鼠急性肺損傷中的作用及機制研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　急性肺損傷(Acute Lung Injury，ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(AcuteRespiratory Distress Syndrome，ARDS)指由心源性以外的各種肺內(nèi)外致病因素導致的肺部炎性反應(yīng)，使肺泡-毛細血管上皮細胞及肺部屏障結(jié)構(gòu)受損，肺氣體交換功能發(fā)生障礙，是一種以急性、進行性、頑固性低氧血癥為特征的臨床綜合征，是目前導致危重病人死亡的主要原因。盡管不斷出現(xiàn)新的治療ALI/ARDS的方法

2、，包括肺保護性通氣策略、體外膜肺氧合、高容量血液濾過等，但其死亡率依然高達30％～50％。在ALI/ARDS發(fā)生發(fā)展過程中，肺泡巨噬細胞介導的固有免疫反應(yīng)發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當肺組織受到肺內(nèi)外各種因素刺激時，可以活化肺泡巨噬細胞膜上的Toll受體(Toll-like receptors，TLRs)，再經(jīng)信號蛋白的轉(zhuǎn)導活化核轉(zhuǎn)錄因子-KappaB（nuclear factor-KappaB，NF-κB），誘導大量炎癥因子的表達釋放，促使炎癥反

3、應(yīng)的級聯(lián)放大，形成肺內(nèi)炎癥“瀑布”反應(yīng)，導致ALI/ARDS的發(fā)生。因此，抑制肺泡巨噬細胞過度活化、降低肺內(nèi)炎癥反應(yīng)是治療ALI/ARDS的根本措施。microRNA-146a(miR-146a)在固有免疫反應(yīng)的調(diào)控中具有重要作用，它通過靶向沉默TLRs/NF-κB信號通路中的兩個關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導蛋白，能夠阻斷NF-κB活化，從而抑制炎癥因子的釋放，有望成為抑制肺泡巨噬細胞過度活化，降低肺內(nèi)炎癥反應(yīng)的有效措施。本實驗首先通過體外構(gòu)建肺泡巨噬

4、細胞炎癥反應(yīng)模型，觀察miR-146a和炎癥因子的表達變化，分析miR-146a在肺泡巨噬細胞炎癥反應(yīng)中的調(diào)控作用，然后經(jīng)體外轉(zhuǎn)染miR-146amimic上調(diào)肺泡巨噬細胞內(nèi)miR-146a的表達，觀察miR-146a對炎癥因子和炎癥信號通路關(guān)鍵蛋白表達的影響，分析它在肺泡巨噬細胞炎癥反應(yīng)中的調(diào)控機制，最后于體內(nèi)構(gòu)建大鼠ALI模型，觀察miR-146a在肺損傷組織中的表達變化，并結(jié)合體外研究結(jié)果，探討其在大鼠ALI模型中的調(diào)控作用及作用

5、機制，為臨床治療ALI提供新的治療思路。
　　研究內(nèi)容和方法:
　　1體外實驗
　　(1)將體外培養(yǎng)的大鼠肺泡巨噬細胞(NR8383)按2×106個/孔接種于六孔板，細胞貼壁90min，加入終濃度1μg/ml LPS處理細胞，于刺激0h、3h、6h、12h的各個時間點收集細胞和細胞上清液。用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)分別檢測細胞中TNF-α mRNA和miR-146a的表達變化，用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA

6、)檢測細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α蛋白的表達變化;
　　(2)將體外培養(yǎng)的NR8383細胞按1.5×106個/孔接種于六孔板，細胞貼壁90min，加入50nM濃度的miR-146a mimic轉(zhuǎn)染NR8383細胞24h后收集細胞。用RT-qPCR檢測細胞中miR-146a上調(diào)的表達倍數(shù)和miR-146a兩個靶基因IRAK-1 mRNA和TRAF-6 mRNA的表達變化，用Western blot檢測細胞內(nèi)IRAK-1和TRAF-6的

7、表達變化，驗證miR-146a轉(zhuǎn)染的有效性以及驗證miR-146a的靶基因;
　　(3)將體外培養(yǎng)的NR8383細胞按1.5×106個/孔接種于六孔板，細胞貼壁90min，加入50nM濃度的miR-146amimic轉(zhuǎn)染NR8383細胞24h，再加入終濃度1μg/ml LPS處理細胞6h后收集細胞和細胞上清液。用RT-qPCR檢測細胞中TNF-α mRNA和miR-146a的表達變化，用ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α蛋白

8、的表達變化，用免疫熒光及Western blot檢測細胞內(nèi)NF-κB p65的核移位變化，明確miR-146a對炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用及作用機制。
　　2體內(nèi)實驗
　　選擇雄性SPF級8～10周齡SD大鼠，按7.5mg/kg的脂多糖，經(jīng)氣道滴入大鼠肺部誘導ALI模型，造模6小時后處死大鼠，檢測肺損傷程度。留取右肺行肺泡灌洗，用ELISA檢測灌洗液中TNF-α蛋白的表達變化;留取左肺用RT-qPCR檢測肺組織中miR-146a以及

9、TNF-α mRNA的表達變化、用Western blot檢測NF-κB p65含量變化。
　　結(jié)果:
　　1.體外實驗結(jié)果
　　(1) LPS刺激NR8383細胞后，誘導了細胞內(nèi)炎癥因子TNF-α的表達變化，其中3、6、12h時間點的TNF-αmRNA表達量分別是0h對照組的67.48±24.52倍（P＜0.01）、29.53±4.26倍(P＜0.01)、11.37±2.52倍(P＜0.01);細胞上清液中TNF-α

10、蛋白的含量于LPS刺激0h后逐漸上升，0h為29.53±7.80pg/ml、3h為359.80±57.54pg/ml(P＜0.01)、6h為586.22±30.57 pg/ml(P＜0.01)、12h為729.22±50.40 pg/ml(P＜0.01)。
　　(2) LPS刺激NR8383細胞后，誘導了細胞內(nèi)炎癥因子TNF-α的表達變化，同時也誘導了miR-146a的表達變化，3h與0h miR-146a表達量差異無統(tǒng)計學意義、

11、6h和12hmiR-146a的表達量逐漸升高，分別是0h的5.33±0.81倍（P＜0.01）和8.21±1.19倍(P＜0.01)。
　　(3)轉(zhuǎn)染50nM濃度的miR-146a mimic入NR8383細胞24h后，與control相比較，miR-146a的表達量上調(diào)至24.55±6.14倍(P＜0.01)，miR-146a的靶基因IRAK-1 mRNA和TRAF-6 mRNA表達量無明顯變化，而IRAK-1和TRAF-6蛋白

12、表達水平分別下降至0.73±0.05倍（P＜0.05）和0.64±0.09倍（P＜0.05）。
　　(4)轉(zhuǎn)染50nM濃度的miR-146amimic入NR8383細胞24h后，給予LPS刺激6h后，相對control組，轉(zhuǎn)染miR-146a mimic組TNF-α mRNA表達下降至0.47±0.06倍（P＜0.05），細胞上清液中TNF-α蛋白從616.6±42.28pg/ml下降至211.5±30.39pg/ml（P＜0.0

13、1），細胞漿中NF-κB p65蛋白含量增加至1.74±0.11倍（P＜0.05），細胞核中NF-κB p65蛋白含量下降至0.56±0.12倍(P＜0.05)，NF-κBp65核移位明顯受到抑制。
　　2.體內(nèi)實驗結(jié)果:
　　LPS氣管滴入大鼠肺部6h后，ALI模型構(gòu)建成功:氧和指數(shù)＜300mmHg,肺病理損傷嚴重、模型組肺泡灌洗液中TNF-α蛋白為506.4±40.3pg/ml，明顯高于對照組48.51±12.11pg/

14、ml(P＜0.01);相對于對照組，模型組肺組織細胞漿中NF-κB p65蛋白含量下降至0.37±0.14倍(P＜0.05)，細胞核中NF-κB p65蛋白含量增加至2.43±0.12倍（P＜0.05）、TNF-α mRNA表達上調(diào)了3.61±1.03倍(P＜0.05)，miR-146a的表達上升2.07±0.26倍（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　在LPS誘導的肺泡巨噬細胞炎癥反應(yīng)中，miR-146a通過靶向作用于TLR