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文檔簡介
1、研究背景和目的:
急性肺損傷(Acute Lung Injury,ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(AcuteRespiratory Distress Syndrome,ARDS)指由心源性以外的各種肺內(nèi)外致病因素導致的肺部炎性反應(yīng),使肺泡-毛細血管上皮細胞及肺部屏障結(jié)構(gòu)受損,肺氣體交換功能發(fā)生障礙,是一種以急性、進行性、頑固性低氧血癥為特征的臨床綜合征,是目前導致危重病人死亡的主要原因。盡管不斷出現(xiàn)新的治療ALI/ARDS的方法
2、,包括肺保護性通氣策略、體外膜肺氧合、高容量血液濾過等,但其死亡率依然高達30%~50%。在ALI/ARDS發(fā)生發(fā)展過程中,肺泡巨噬細胞介導的固有免疫反應(yīng)發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當肺組織受到肺內(nèi)外各種因素刺激時,可以活化肺泡巨噬細胞膜上的Toll受體(Toll-like receptors,TLRs),再經(jīng)信號蛋白的轉(zhuǎn)導活化核轉(zhuǎn)錄因子-KappaB(nuclear factor-KappaB,NF-κB),誘導大量炎癥因子的表達釋放,促使炎癥反
3、應(yīng)的級聯(lián)放大,形成肺內(nèi)炎癥“瀑布”反應(yīng),導致ALI/ARDS的發(fā)生。因此,抑制肺泡巨噬細胞過度活化、降低肺內(nèi)炎癥反應(yīng)是治療ALI/ARDS的根本措施。microRNA-146a(miR-146a)在固有免疫反應(yīng)的調(diào)控中具有重要作用,它通過靶向沉默TLRs/NF-κB信號通路中的兩個關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導蛋白,能夠阻斷NF-κB活化,從而抑制炎癥因子的釋放,有望成為抑制肺泡巨噬細胞過度活化,降低肺內(nèi)炎癥反應(yīng)的有效措施。本實驗首先通過體外構(gòu)建肺泡巨噬
4、細胞炎癥反應(yīng)模型,觀察miR-146a和炎癥因子的表達變化,分析miR-146a在肺泡巨噬細胞炎癥反應(yīng)中的調(diào)控作用,然后經(jīng)體外轉(zhuǎn)染miR-146amimic上調(diào)肺泡巨噬細胞內(nèi)miR-146a的表達,觀察miR-146a對炎癥因子和炎癥信號通路關(guān)鍵蛋白表達的影響,分析它在肺泡巨噬細胞炎癥反應(yīng)中的調(diào)控機制,最后于體內(nèi)構(gòu)建大鼠ALI模型,觀察miR-146a在肺損傷組織中的表達變化,并結(jié)合體外研究結(jié)果,探討其在大鼠ALI模型中的調(diào)控作用及作用
5、機制,為臨床治療ALI提供新的治療思路。
研究內(nèi)容和方法:
1體外實驗
(1)將體外培養(yǎng)的大鼠肺泡巨噬細胞(NR8383)按2×106個/孔接種于六孔板,細胞貼壁90min,加入終濃度1μg/ml LPS處理細胞,于刺激0h、3h、6h、12h的各個時間點收集細胞和細胞上清液。用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)分別檢測細胞中TNF-α mRNA和miR-146a的表達變化,用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA
6、)檢測細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α蛋白的表達變化;
(2)將體外培養(yǎng)的NR8383細胞按1.5×106個/孔接種于六孔板,細胞貼壁90min,加入50nM濃度的miR-146a mimic轉(zhuǎn)染NR8383細胞24h后收集細胞。用RT-qPCR檢測細胞中miR-146a上調(diào)的表達倍數(shù)和miR-146a兩個靶基因IRAK-1 mRNA和TRAF-6 mRNA的表達變化,用Western blot檢測細胞內(nèi)IRAK-1和TRAF-6的
7、表達變化,驗證miR-146a轉(zhuǎn)染的有效性以及驗證miR-146a的靶基因;
(3)將體外培養(yǎng)的NR8383細胞按1.5×106個/孔接種于六孔板,細胞貼壁90min,加入50nM濃度的miR-146amimic轉(zhuǎn)染NR8383細胞24h,再加入終濃度1μg/ml LPS處理細胞6h后收集細胞和細胞上清液。用RT-qPCR檢測細胞中TNF-α mRNA和miR-146a的表達變化,用ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α蛋白
8、的表達變化,用免疫熒光及Western blot檢測細胞內(nèi)NF-κB p65的核移位變化,明確miR-146a對炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用及作用機制。
2體內(nèi)實驗
選擇雄性SPF級8~10周齡SD大鼠,按7.5mg/kg的脂多糖,經(jīng)氣道滴入大鼠肺部誘導ALI模型,造模6小時后處死大鼠,檢測肺損傷程度。留取右肺行肺泡灌洗,用ELISA檢測灌洗液中TNF-α蛋白的表達變化;留取左肺用RT-qPCR檢測肺組織中miR-146a以及
9、TNF-α mRNA的表達變化、用Western blot檢測NF-κB p65含量變化。
結(jié)果:
1.體外實驗結(jié)果
(1) LPS刺激NR8383細胞后,誘導了細胞內(nèi)炎癥因子TNF-α的表達變化,其中3、6、12h時間點的TNF-αmRNA表達量分別是0h對照組的67.48±24.52倍(P<0.01)、29.53±4.26倍(P<0.01)、11.37±2.52倍(P<0.01);細胞上清液中TNF-α
10、蛋白的含量于LPS刺激0h后逐漸上升,0h為29.53±7.80pg/ml、3h為359.80±57.54pg/ml(P<0.01)、6h為586.22±30.57 pg/ml(P<0.01)、12h為729.22±50.40 pg/ml(P<0.01)。
(2) LPS刺激NR8383細胞后,誘導了細胞內(nèi)炎癥因子TNF-α的表達變化,同時也誘導了miR-146a的表達變化,3h與0h miR-146a表達量差異無統(tǒng)計學意義、
11、6h和12hmiR-146a的表達量逐漸升高,分別是0h的5.33±0.81倍(P<0.01)和8.21±1.19倍(P<0.01)。
(3)轉(zhuǎn)染50nM濃度的miR-146a mimic入NR8383細胞24h后,與control相比較,miR-146a的表達量上調(diào)至24.55±6.14倍(P<0.01),miR-146a的靶基因IRAK-1 mRNA和TRAF-6 mRNA表達量無明顯變化,而IRAK-1和TRAF-6蛋白
12、表達水平分別下降至0.73±0.05倍(P<0.05)和0.64±0.09倍(P<0.05)。
(4)轉(zhuǎn)染50nM濃度的miR-146amimic入NR8383細胞24h后,給予LPS刺激6h后,相對control組,轉(zhuǎn)染miR-146a mimic組TNF-α mRNA表達下降至0.47±0.06倍(P<0.05),細胞上清液中TNF-α蛋白從616.6±42.28pg/ml下降至211.5±30.39pg/ml(P<0.0
13、1),細胞漿中NF-κB p65蛋白含量增加至1.74±0.11倍(P<0.05),細胞核中NF-κB p65蛋白含量下降至0.56±0.12倍(P<0.05),NF-κBp65核移位明顯受到抑制。
2.體內(nèi)實驗結(jié)果:
LPS氣管滴入大鼠肺部6h后,ALI模型構(gòu)建成功:氧和指數(shù)<300mmHg,肺病理損傷嚴重、模型組肺泡灌洗液中TNF-α蛋白為506.4±40.3pg/ml,明顯高于對照組48.51±12.11pg/
14、ml(P<0.01);相對于對照組,模型組肺組織細胞漿中NF-κB p65蛋白含量下降至0.37±0.14倍(P<0.05),細胞核中NF-κB p65蛋白含量增加至2.43±0.12倍(P<0.05)、TNF-α mRNA表達上調(diào)了3.61±1.03倍(P<0.05),miR-146a的表達上升2.07±0.26倍(P<0.05)。
結(jié)論:
在LPS誘導的肺泡巨噬細胞炎癥反應(yīng)中,miR-146a通過靶向作用于TLR
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