βig-h3在胃癌腹膜轉移中的作用及機制的研究.pdf

1、第一部分腹膜間皮細胞表達βig-h3與胃癌病理及腹膜轉移相關因素的關系
　　 目的：
　　 探討胃癌患者腹膜間皮細胞中βig-h3表達與胃癌生物學行為及腹膜轉移相關因素的關系。
　　 材料與方法：
　　 一、研究對象
　　 病例來源于2011年5月-9月間中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腫瘤外科胃癌手術病例75例，其中男性51例，女性24例；平均年齡61歲(32-81歲)。另收集14例同期胃良性病變標本作

2、為對照。
　　 二、實驗方法
　　 (一)取材手術開腹后，留取腹腔沖洗液，取部分腹腔液行細胞學檢查(Peritoneal lavage Cytology，PLC)；其余沖洗液沉渣提取總RNA深低溫冰箱凍存，擇期行RT-PCR檢測腹腔液中CEA mRNA。腹膜組織取自前下方腹壁，并立刻固定于10％的甲醛溶液，石蠟包埋、切片(5μm)，擇期行免疫組織化學染色。
　　 (二)結果分析按同本胃癌病理規(guī)約標準判定病理因素。

3、根據(jù)胃癌腹腔沖洗液PLC檢查結果分組為：PLC(-)組、PLC(+)組。排除非特異性染色的前提下，以腹膜間皮細胞胞質內出現(xiàn)黃色、棕黃色、淺褐色顆粒為陽性標記。PCR擴增后產(chǎn)物經(jīng)含EB染色劑的2%瓊脂糖凝膠電泳，以199bp出現(xiàn)陽性條帶為CEA mRNA陽性。
　　 三、統(tǒng)計學分析
　　 實驗數(shù)據(jù)應用SpSS16.0統(tǒng)計軟件包進行分析。各組間指標比較用x2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：

4、　　 一、胃癌和良性疾病對照組腹膜組織βig-h3免疫組化染色結果
　　 75例胃癌患者中，29例腹膜組織βig-h3免疫組化染色結果呈陽性，46例呈陰性。14例胃良性疾病患者中，1例呈陽性。胃癌組陽性比率明顯高于良性疾病組，差異具有統(tǒng)計學意義(p=0.030)。
　　 二、腹膜組織βig-h3免疫組化染色結果與胃癌病理生物學行為的關系
　　 腹膜組織免疫組化陽性率在未分化、彌漫狀生長、淋巴結轉移陽性的胃癌中升

5、高，但差異不具有統(tǒng)計學意義；在浸透漿膜(T4)(p=0.016)、漿膜呈腱狀及多彩彌漫型組(p=0.037)中明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 三、腹膜組織βig-h3免疫組化染色結果與肉眼腹膜轉移、PLC檢查及CEA mRNA結果的關系
　　 75例胃癌病例中，13例伴有肉眼腹膜轉移，20例腹腔脫落癌細胞呈陽性；32例CEA mRNA結果陽性。βig-h3表達陽性率在肉眼腹膜轉移陽性(p=0.002)、腹腔脫落癌細

6、胞陽性(p=0.005)及CEA mRNA陽性組(p=0.027)明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 結論：
　　 (1)胃癌患者腹膜間皮細胞可表達細胞外基質蛋白βig-h3。
　　 (2)胃癌患者腹膜間皮細胞中βig-h3的表達量，隨胃癌病期進展而增加。
　　 (3)胃癌患者腹膜間皮細胞中βig-h3的表達量與多種胃癌腹膜轉移相關因素密切相關，可成為預測胃癌腹膜轉移的指標之一。
　　 第二部分

7、胃癌細胞上清及轉化生長因子-β1促進腹膜間皮細胞βig-h3蛋白的表達
　　 目的：
　　 研究胃癌細胞SGC-7901上清及轉化生長因子-β1(TGF-β1)可否促進人類腹膜間皮細胞表達βig-h3蛋白。
　　 材料與方法：
　　 一、材料
　　 胎牛血清(FBS)、RPMI1640和DMEM培養(yǎng)基、重組人TGF-β1：人類腹膜間皮細胞系HMrSV5；胃癌細胞系SGC-7901；Anti-βig

8、-h3抗體和βig-h3 ELISA試劑盒；辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG；超速離心機4K15；二氧化碳培養(yǎng)箱。
　　 二、方法
　　 培養(yǎng)胃癌細胞SGC-7901，第3天培養(yǎng)液上清與DMEM培養(yǎng)液1:4混合液及0，1.0，10.0，50.0ng/ml TGF-β1分別刺激人類腹膜間皮細胞HMrSV50、3、6、12、24小時，ELISA方法檢測上清液中βig-h3蛋白濃度，Western-blot檢測細胞內βig-h3

9、蛋白濃度。
　　 三、統(tǒng)計學處理
　　 所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(X-±S)表示，應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行分析。各組間指標比較用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 一、TGF-β1對腹膜間皮細胞培養(yǎng)液及細胞內表達βig-h3水平的影響。
　　 正常對照組細胞上清液中有基礎量的βig-h3蛋白分泌，TGF-β1可刺激腹膜間皮細胞分泌βig-h3，且呈時間及濃度依賴性

10、。TGF-β1增加腹膜間皮細胞內βig-h3蛋白量，并呈時間及濃度依賴性。
　　 二、胃癌細胞上清刺激對聞皮細胞培養(yǎng)液中βig-h3及間皮細胞內表達βig-h3水平的影響。
　　 胃癌細胞上清刺激間皮細胞，培養(yǎng)液中βig-h3于24小時可獲得最大濃度。腹膜間皮細胞內βig-h3表達含量于12小時達到高峰。
　　 結論：
　　 (1)正常腹膜間皮細胞可表達、分泌細胞外基質蛋白βig-h3。
　　 (

11、2)胃癌細胞上清及TGF-β1可促進腹膜間皮細胞可表達、分泌細胞外基質蛋白βig-h3
　　 (3)胃癌細胞上清及TGF-β1的促進作用呈濃度及時間依賴性增加。
　　 第三部分細胞外基質蛋白βig-h3誘導胃癌細胞SGC-7901粘附、增殖及遷移
　　 目的：
　　 研究細胞外基質蛋白βig-h3可否誘導胃癌細胞SGC-7901粘附、遷移及增殖。
　　 材料與方法：
　　 一、材料

12、　　 胎牛血清(FBS)、RPMI1640培養(yǎng)基、重組人βig-h3蛋白及四甲基偶氮唑藍(MTT)、纖維粘連蛋白(FN)、Transwell小室、胃癌細胞系SGC-7901、超速離心機4K15、二氧化碳培養(yǎng)箱。
　　 二、方法
　　 (一)MTT法檢測SGC7901細胞與βig-h3的粘附及增殖程度
　　 胎牛血清(BSA)、纖維粘連蛋白(FN)及細胞外基質蛋白βig-h3包被96孔板后，對數(shù)生長期的人胃癌細胞

13、SGC-7901接種于96孔細胞培養(yǎng)板內。應用MTT法檢測其與βig-h3粘附能力及粘附后的增殖能力
　　 (二)Transwell小室侵襲實驗檢測βig-h3誘導SGC7901細胞遷移的能力
　　 在Transwell小室濾膜下表面覆以人重組βig-h3、BSA及FN包被，上室加入SGC-7901細胞懸液。37℃培養(yǎng)24小時，清洗，0.1%結晶紫染色10 min。光鏡下觀察記錄膜背面侵襲的細胞數(shù)。
　　 三、統(tǒng)

14、計學處理
　　 所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(X±S)表示，應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件包進行分析。各組間指標比較用方差分析或t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果
　　 一、βig-h3支持SGC-7901細胞的粘附及增殖
　　 SGC-7901細胞對βig-h3和FN的粘附能力明顯高于BSA，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.023)；βig-h3和FN兩組間差異不明顯(P>0.05)。BSA、FN

15、和βig-h3促進SGC-7901細胞增殖的能力漸次增強，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.031)。
　　 二、βig-h3誘導SGC-7901細胞的遷移
　　 Transwell小室侵襲實驗證實：βig-h3和FN具有更強的誘導SGC-7901細胞遷移的能力，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.019)。Big-h3和FN兩組之間無顯著差異(P>0.05)。
　　 結論：
　　 (1)βig-h3可誘導細胞粘附，其