載體介導(dǎo)siRNA抑制人RA滑膜細(xì)胞NF-κB基因表達(dá)的研究.pdf

1、目的：設(shè)計(jì)、合成核轉(zhuǎn)錄因子-kappaB(Nuclear transcription factor-kappaB，NF-kB)小分子干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)滑膜細(xì)胞，篩選出特異性干擾人RA滑膜細(xì)胞NF-kB生成的siRNA表達(dá)載體，以探索抑制RA炎癥進(jìn)展和關(guān)節(jié)破壞的新途徑。 方法: RA滑膜細(xì)胞源自RA滑膜切

2、除組織，經(jīng)分離、消化、培養(yǎng)和傳代后備用。根據(jù)GeneBank中人NF-kB mRNA全長(zhǎng)開放讀框序列(L19067)，設(shè)計(jì)合成四條NF-kB的干擾序列(1＃～4＃)及對(duì)照序列，構(gòu)建siRNA pGenesil-1/NF-kB表達(dá)載體，以復(fù)合陽(yáng)離子脂質(zhì)體Effectene Transfection Reagent為介導(dǎo)，轉(zhuǎn)染重組真核表達(dá)載體NF-kB siRNA入滑膜細(xì)胞，轉(zhuǎn)染12h、24h、48h、72h、5d和第7d后分別收集細(xì)胞，提

3、取上述時(shí)間段細(xì)胞總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(引物、探針均根據(jù)GeneBank中NF-kB mRNA全長(zhǎng)開放讀框序列設(shè)計(jì)合成擴(kuò)增)，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time fluorescent quantitive polymerase chain reaction，F(xiàn)Q-PCR)檢測(cè)滑膜細(xì)胞中NF-kBmRNA相對(duì)表達(dá)水平，分析重組真核載體的干擾效果。 結(jié)果: NF-kB真核表達(dá)載體pGenesil-1/NF-kB siRN

4、A轉(zhuǎn)染人滑膜細(xì)胞12h、48h、72h、5d和7d后，觀察到陽(yáng)離子脂質(zhì)體Effectene Transfection Reagent對(duì)細(xì)胞毒性小，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上沒有差別，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)沒有明顯影響。熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)測(cè)定各時(shí)間段各組人滑膜細(xì)胞NF-kB mRNA的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后12小時(shí)內(nèi)即可檢測(cè)到干擾效應(yīng)，48～72小時(shí)干擾效應(yīng)最強(qiáng)，此后活性逐漸降低，持續(xù)時(shí)間達(dá)7天，并且3＃Genesil-1/NF-kBsiRNA組與其它si