Nrf2及NQO1在膀胱癌中的表達(dá)及意義.pdf

1、目的:
　　 膀胱癌是泌尿系腫瘤中最常見(jiàn)的腫瘤，其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因多階段的過(guò)程，是環(huán)境和遺傳因素共同作用的結(jié)果。高發(fā)、多發(fā)、復(fù)發(fā)為其特點(diǎn)，淺表性腫瘤易復(fù)發(fā)，浸潤(rùn)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤預(yù)后則較差。從功能角度看，膀胱癌屬蛋白組性疾病。因此在研究癌基因及抑癌基因的同時(shí)腫瘤專家們開(kāi)始關(guān)注癌細(xì)胞表面向細(xì)胞核內(nèi)信息傳遞過(guò)程，試圖揭示腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。紅系衍生的核因子2相關(guān)因子(Nrf2)屬于CNC轉(zhuǎn)錄因子家族成員，是參與生物體內(nèi)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)

2、的一種重要轉(zhuǎn)錄因子。NQO1是醌氧化還原酶，為Nrf2/ARE抗氧化系統(tǒng)中下游調(diào)節(jié)序列表達(dá)蛋白。大量的研究證實(shí)Nrf2可在肝臟、消化道、肺臟、心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)中高表達(dá)，究其原因是因?yàn)镹rf2作為抗氧化元件，能夠減少有害的內(nèi)源性和外源性的刺激物對(duì)正常細(xì)胞的損傷。研究表明Nrf2參與了多種器官的抗氧化反應(yīng)，在氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。目前Nrf2在腎、肺、肝等代謝器官中的作用研究較多，非代謝器官中的作用研究較少，且大多為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，人

3、體病理標(biāo)本實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道較少。研究表明Nrf2在促進(jìn)肝臟解毒的同時(shí)會(huì)增加膀胱致癌物質(zhì)如4-氨基聯(lián)苯、丁基氫醌的暴露機(jī)會(huì)。本研究擬檢測(cè)Nrf2、NQO1分別在膀胱癌組織及癌旁組織中的表達(dá)水平，探討Nrf2/ARE信號(hào)傳導(dǎo)通路在膀胱癌中的作用及其機(jī)制，從而進(jìn)一步了解膀胱癌的發(fā)病機(jī)制，為膀胱癌的診治提供新的思路。
　　 方法:
　　 選取2011年6月至2012年9月河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科住院手術(shù)病人的46例膀胱癌組織和1

4、8例癌旁組織（距瘤體邊緣5cm以外，病理證實(shí)為正常膀胱組織），其中男性26例，女性20例，年齡45至77歲，平均年齡56.6歲，全部病例術(shù)前均未經(jīng)任何放療、化療。標(biāo)本分為兩份，一份經(jīng)10％甲醛溶液固定，石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，另一份保存于液氮中。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)2004年分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理分級(jí):高級(jí)別19例，低級(jí)別27例;根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟2002年TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期:非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌（Tis-T1）30例，肌層浸潤(rùn)

5、性膀胱癌（T2-T4）16例。
　　 1.免疫組織化學(xué)方法檢測(cè):從蛋白水平檢測(cè)46例患者膀胱癌組織和18例癌旁組織中Nrf2及NQO1的表達(dá)。統(tǒng)計(jì)染色陽(yáng)性率數(shù)值，運(yùn)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，比較膀胱癌組織和癌旁組織中Nrf2及NQO1的陽(yáng)性表達(dá)率之間的差異，以及與病理分級(jí)、臨床分期及轉(zhuǎn)移的關(guān)系。采用x2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法檢驗(yàn)，認(rèn)為P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Nrf2與NQO1關(guān)系采用Pearson相關(guān)分析。

6、
　　 2.Westernblotting檢測(cè):將膀胱癌組織及癌旁組織于冰浴下制成勻漿，離心分離取上清液，進(jìn)行蛋白定量，取蛋白提取液100μg，按比例與上樣緩沖液混勻，煮沸，上樣，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)膜法至PVDF膜上，置于封閉液中封閉，隨后與相應(yīng)的一抗、二抗試劑反應(yīng)，用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)結(jié)合區(qū)帶，數(shù)碼成像分析系統(tǒng)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量分析。將Nrf2及NQO1蛋白條帶的光密度與相應(yīng)的內(nèi)參蛋白β-actin條帶的光密度

7、的比值做為蛋白表達(dá)的相對(duì)表達(dá)值，采用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果:
　　 1.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示:Nrf2蛋白在膀胱癌組織中及癌旁組織中陽(yáng)性表達(dá)率分別76.1％和27.8％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);NQO1蛋白在膀胱癌組織中及癌旁組織中陽(yáng)性表達(dá)率分別71.7％和22.2％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);Nrf2、NQO1蛋白在膀胱癌組織中的表達(dá)與腫瘤分級(jí)、臨床分期及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān);Nrf2

8、與NQO1在膀胱癌組織中表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.678，P＜0.01)。
　　 2.Westernblotting檢測(cè)結(jié)果顯示:取18例癌旁組織與相應(yīng)膀胱癌組織，Westernblotting抗原抗體區(qū)帶定量，比較分析膀胱癌組織Nrf2、NQO1蛋白水平高于癌旁組織，Nrf2在膀胱癌組織中相對(duì)表達(dá)量為0.2153±0.0202，在癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量為0.1784±0.0185差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.723P=0.000），N

9、QO1蛋白在膀胱癌中相對(duì)表達(dá)量為0.1759±0.0135，在癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量為0.1585±0.0132，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.344P=0.000)。
　　 結(jié)論:
　　 1.Nrf2、NQO1蛋白在膀胱癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織中的表達(dá)。
　　 2.Nrf2、NQO1蛋白在膀胱癌組織中的表達(dá)與腫瘤分級(jí)、臨床分期及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。
　　 3.Nrf2蛋白與NQO1蛋白在膀胱癌組織中的表