嗜麥芽窄食單胞菌L1、L2兩種β內(nèi)酰胺酶研究.pdf

1、[目的]1)了解嗜麥芽窄食單胞菌醫(yī)院感染的相關獨立危險因素及分子流行病學特征；2)擴增、定位L1、L2兩種β內(nèi)酰胺酶基因，并行接合轉(zhuǎn)移試驗，了解是否伴有耐藥性轉(zhuǎn)移；3)比較常用抗生素頭孢他啶、頭孢噻肟、亞胺培南、美洛培南對兩種酶的誘導作用以及兩種酶的調(diào)控關系；4)研究L1酶基因220位堿突變引起的Asp74突變對L1酶功能的影響；5)初步探討磺胺類藥物耐藥機制。 [方法]1)臨床分離引起醫(yī)院內(nèi)感染的嗜麥芽窄食單胞菌30株，經(jīng)VI

2、TEK微生物鑒定系統(tǒng)重新鑒定。采用微量肉湯稀釋法監(jiān)測14種抗生素的MIC；采用1：1病例對照研究，Logistic多因素回歸分析篩選出導致該菌感染的危險因子；應用ERIC-PCR方法分析嗜麥芽窄食單胞菌的流行特征；2)提取嗜麥芽窄食單胞菌質(zhì)粒DNA，確定攜帶質(zhì)粒的數(shù)目及大小；用細菌染色體DNA和不同大小的質(zhì)粒DNA為模板進行PCR擴增L1、L2兩種酶基因，確定產(chǎn)兩種酶的菌株數(shù)以及L1、L2酶基因的定位；行接合轉(zhuǎn)移試驗，確定是否有耐藥性轉(zhuǎn)

3、移；3)采用RT-PCR方法，確定不同濃度的臨床常用抗生素(0.25、1、4×MIC)，如頭孢他啶、頭孢噻肟、亞胺培南、美洛培南對L1、L2兩種酶的誘導作用以及兩種酶的調(diào)控關系；4)在野生型L1基因基礎上采用重疊PCR法定點突變220位堿基，產(chǎn)物亞克隆入pET28a(+)表達載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)并表達，獲得野生型和三種突變型L1酶，即Asp74分別突變?yōu)镠is、Asn和Tyr。比較野生型和突變型L1酶的表達量、酶活性。

4、5)設計特異性引物，在臨床分離嗜麥芽窄食單胞菌中擴增1型整合子特異的整合酶基因和sull基因，產(chǎn)物克隆、測序。比較磺胺類藥物耐藥菌株和敏感菌株攜帶1型整合子和sull基因的差異。 [結(jié)果]1)30株嗜麥芽窄食單胞菌對亞胺培南、美洛培南、頭孢噻肟、氨曲南、阿米卡星高度耐藥；但對頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、復方新諾明、替卡西林/克拉維酸仍保持一定敏感性，敏感率分別為96.7％、76.7％、73.3和60％％。獨立危險因素為

5、機械通氣(0R=7.629)和住院時間＞60天(0R=4.466)。ERIC-PCR指紋圖譜顯示30株嗜麥芽窄食單胞菌由26種不同克隆構(gòu)成。2)13株嗜麥芽窄食單胞菌質(zhì)粒譜分析，除1株外均發(fā)現(xiàn)約12kb大小的質(zhì)粒。以細菌染色體DNA為模板，擴增L2基因均為陽性；除3株為陰性外，27株菌的L1基因為陽性。分別以不同大小的質(zhì)粒為模板，以L1、L2引物進行PCR，12kb的質(zhì)粒擴增到陽性片斷。將L1、L2基因的擴增產(chǎn)物分別克隆到pMD18-T

6、載體，測序。將測得的序列和網(wǎng)上注冊的基因序列，應用DNAStar構(gòu)建分子進化樹，除1株菌外，其他8株菌的L1基因與L1c同源性高，與L1e同源性低。3株菌的L2基因與L2b同源性高，與L2d同源性低。接合轉(zhuǎn)移試驗顯示：接合子能夠在含氨芐西林、利福平、萘啶酸的麥康凱培養(yǎng)基上生長并傳代，而在含利福平、萘啶酸和亞胺培南(美洛培南、頭孢他啶、頭孢噻肟)的培養(yǎng)基上未見菌落生長。將接合子增菌后抽提質(zhì)粒發(fā)現(xiàn)12kb大小的質(zhì)粒。3)將不同濃度的頭孢他啶

7、、頭孢噻肟、亞胺培南、美洛培南(0.25、1、4×MIC)分別加入同時產(chǎn)L1、L2兩種β內(nèi)酰胺酶的嗜麥芽窄食單胞菌LB培養(yǎng)基中，提取總RNA，用特異性L1、L2引物行RT-PCR，結(jié)果示不加任何抗生素的空白對照和含有不同濃度亞胺培南、美洛培南以及4×MIC的頭孢噻肟菌株未見電泳條帶，而0.25、1、4×MIC的頭孢他啶和0.25×MIC的頭孢噻肟電泳條帶較弱，只有含1×MIC濃度頭孢噻肟的菌株L1、L2電泳條帶清晰。4)野生型和定點突變

8、的L1基因克隆于T載體測序證實后，亞克隆入表達載體，含目的基因的重組pET28a(+)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導，SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，融合基因表達的蛋白為28.2kDa，其中空質(zhì)粒pET28a(+)表達的蛋白約為2.2kDa，L1酶分子量約為26kDa。Asp74突變?yōu)镠is、Asn和Tyr后，用改良Bradford法測定野生株和三個突變株L1粗提酶的蛋白含量，應用紫外分光光度法測定β內(nèi)酰胺酶活性結(jié)果示，Asp

9、74、His74、Asn74和Tyr74的L1酶活性分別為13.09U/ug、5.79U/ug、9.92U/ug和5.01U/ug。突變?yōu)門yr74時L1酶活性最低，對亞胺培南和美洛培南的水解活性比野生株降低50～100倍，對頭孢菌素類無水解活性。5)30株嗜麥芽窄食單胞菌中，5株(16.7％)擴增1型整合子和sull基因陽性，其余均為陰性。 [結(jié)論]1)嗜麥芽窄食單胞菌對常用抗菌藥物呈多重耐藥，但對頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/

10、他唑巴坦、復方新諾明、替卡西林/克拉維酸仍保持一定敏感性。機械通氣和住院時間＞60天是嗜麥芽窄食單胞菌醫(yī)院感染的獨立危險因素。30株嗜麥芽窄食單胞菌分子流行病學顯示由26種不同克隆構(gòu)成，表現(xiàn)為基因型多態(tài)性。2)嗜麥芽窄食單胞菌攜帶約12kb大小的質(zhì)粒，L1、L2兩種β內(nèi)酰胺酶基因同時位于細菌染色體和該質(zhì)粒上。兩類酶基因的氨基酸同源性多數(shù)在70％～95％之間，表現(xiàn)為明顯異質(zhì)性。分子進化樹可直觀的顯示兩種酶的進化關系和同源性。氨芐西林的耐藥

11、性可從供體菌轉(zhuǎn)移到受體菌，同時伴隨12kb大小質(zhì)粒的移動。3)臨床常用抗生素頭孢他啶和頭孢噻肟對L1、L2兩種酶具有誘導作用，以1×MIC的頭孢噻肟誘導作用最強。頭孢噻肟可同時對兩種酶的轉(zhuǎn)錄起作用，兩種酶可能具有重疊調(diào)控機制。4)Asp74突變?yōu)門yr時酶活性最低，Asp74殘基與L1酶水解β內(nèi)酰胺類抗生素的功能特性密切相關，在酶與底物結(jié)合，催化底物水解反應中起著重要作用。5)1型整合子的存在和sull基因表達可能與磺胺類藥物高度耐藥性