肝硬化患者骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)及誘導分化為肝細胞的實驗研究.pdf

1、目的：探討肝硬化患者骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells MSCs)的體外擴增培養(yǎng)生長特性及其誘導分化為肝功能細胞的能力，為肝組織工程“種子細胞”的選擇提供新的理論依據(jù)，為進一步研究自體骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療肝衰竭時移植細胞在體內(nèi)的調(diào)控機制打下基礎。 方法：無菌抽取我科4例肝硬化志愿者骨髓3～4ml，年齡30～40歲，利用密度梯度離心法(1.073g/L ficoll)聯(lián)合貼壁

2、篩選法逐步篩選MSCs，獲取MSCs，倒置顯微鏡下逐日觀察細胞生長特性，以cell Counter做細胞計數(shù)，繪制細胞生長曲線，流式細胞儀檢測細胞表面標志CD44、CD45。制作細胞爬片，取第三代培養(yǎng)細胞，將細胞分成兩組：A組HGF(20mg/ml)+IL-6(10ng/ml)+基礎培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)。B組(空白對照組)基礎培養(yǎng)基(胎牛血清+L-DMEM)培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察誘導分化過程中細胞形態(tài)變化，分別于誘導培養(yǎng)后0、7、14、21、

3、28d時取出爬片免疫細胞化學染色測定肝細胞特征表型甲胎蛋白(AFP)、細胞角蛋白18(CK18)的表達情況并于誘導培養(yǎng)后多時間點測定培養(yǎng)細胞產(chǎn)生的AFP和CK18的陽性表達率(﹪)，并與空白對照作作以比較，得出結論。 結果：原代培養(yǎng)細胞生長潛伏期0～9d,對數(shù)增殖期為10～19d，生長平臺期為20～24d；傳代細胞生長周期較原代細胞快，細胞生長潛伏期為4～24h，對數(shù)增殖期為3～12d，13～15d進入生長平臺期。肝硬化患者骨髓