新基因KIAA1529調(diào)控卵巢癌紫杉醇耐藥的機制研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，也是婦科腫瘤惡性程度最高的疾病。據(jù)統(tǒng)計，每年出現(xiàn)約22200個卵巢癌新診斷病例，同時超過約15000位卵巢癌患者出現(xiàn)死亡。卵巢癌的早期癥狀較為隱匿。當發(fā)現(xiàn)診斷該疾病時，患者的病情已多發(fā)展為中晚期。目前卵巢癌的治療標準仍為手術治療后輔助以鉑類聯(lián)合紫杉醇的化療方案。但大部分患者最終出現(xiàn)對常規(guī)化療藥物耐藥，從而限制了化療藥物的治療效果。所以在過去的幾十年中，卵巢癌的5年生存率仍

2、徘徊在40％左右，并未出現(xiàn)明顯的改善。在臨床的治療過程中，卵巢癌患者的預后很大程度上取決于患者對治療的反應性，化療方案的制定需根據(jù)患者的病情、手術經(jīng)過、病理診斷等多因素進行綜合評估。而實行個體化的治療方案是目前國內(nèi)外婦科腫瘤醫(yī)師主要的研究目標及方向。
　　紫杉醇作為卵巢癌治療的一線化療藥物，其主要的抗腫瘤作用為誘導并促進腫瘤細胞的微管聚合，產(chǎn)生穩(wěn)定的微管結構，阻止有絲分裂過程中細胞染色體的正常排列及分離，從而抑制細胞周期的進展，最

3、終導致腫瘤細胞凋亡。一般認為，紫杉醇發(fā)揮抗腫瘤效應的重要機制是促進腫瘤細胞微管聚合，抑制腫瘤細胞微管解聚，使細胞分裂阻滯于G2/M期。
　　在本實驗室的前期研究中，通過RNAi文庫技術與蛋白質(zhì)免疫共沉淀，質(zhì)譜分析等蛋白質(zhì)組學的研究方式相結合，在AKT/GSK-3β信號通路中發(fā)現(xiàn)一個新基因KIAA1529可能參與了卵巢癌的紫杉醇耐藥。本研究旨在探討KIAA1529編碼蛋白KA在多種腫瘤細胞系中的表達，并通過藥物干預及RNA干擾技術探

4、討KA在GSK-3β信號通路中卵巢癌對紫杉醇耐藥的作用及相關機制，為逆轉卵巢癌治療過程中出現(xiàn)的紫杉醇耐藥提供一個可能的新的分子治療靶點。
　　方法:
　　收集本實驗室相關腫瘤細胞系，用TRIzol法提取各腫瘤細胞系的總RNA，采用熒光實時定量PCR方法檢測肺癌細胞系、乳腺癌細胞系及卵巢癌細胞系中KIAA1529基因mRNA水平的表達，用蛋白質(zhì)印跡法檢測卵巢癌細胞系中KIAA1529基因編碼蛋白KA的表達。
　　使用GS

5、K-3β特異性抑制劑LiCl通過磷酸化抑制GSK-3β，同時在紫杉醇的作用下，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測不同處理組卵巢癌SKOV3細胞中GSK-3β、p-GSK-3β、KA的蛋白表達變化。用流式細胞儀檢測各組細胞周期的變化及各組細胞有絲分裂指數(shù)的改變。采用對SKOV3細胞中的p-H3及α-tubulin進行免疫熒光染色，觀察各組細胞中進行有絲分裂細胞比例的變化及細胞骨架形態(tài)的改變。用流式細胞儀檢測各組理組細胞的凋亡情況。
　　采用RNA

6、干擾技術，將KA siRNA轉染至卵巢癌SKOV3細胞，熒光實時定量PCR法和蛋白質(zhì)印跡法檢測轉染KA siRNA后對SKOV3細胞中KA表達的抑制效果。通過流式細胞儀檢測在使用GSK-3β特異性抑制劑LiCl后，在紫杉醇作用下對照組與轉染組細胞周期及細胞有絲分裂指數(shù)的變化。采用對對照組及轉染組SKOV3細胞中p-H3及α-tubulin的熒光染色，觀察兩組間細胞有絲分裂細胞比例的變化及細胞骨架形態(tài)的改變。用流式細胞儀檢測兩組細胞的凋亡

7、情況。
　　使用GSK-3β特異性抑制劑LiCl后，在紫杉醇作用下，通過蛋白質(zhì)印跡法檢測卵巢癌SKOV3細胞中有絲分裂紡錘體檢測點相關蛋白的表達變化。采用RNA干擾技術，將KA siRNA轉染卵巢癌SKOV3細胞，用蛋白質(zhì)印跡法檢測在使用GSK-3β特異性抑制劑LiCl后，紫杉醇作用下，對照組及轉染組有絲分裂紡錘體檢測點相關蛋白的表達變化。
　　采用RNA干擾技術，將Aurora B siRNA轉染至SKOV3細胞，用蛋白質(zhì)

8、印跡法檢測轉染Aurora B siRNA后，對SKOV3細胞中Aurora B蛋白表達的抑制效果。通過流式細胞儀檢測對照組與轉染組細胞有絲分裂指數(shù)的變化。采用對p-H3及α-tubulin的熒光染色，觀察對照組與轉染組細胞有絲分裂比例的變化及細胞骨架形態(tài)的改變。用流式細胞儀檢測對照組及轉染組細胞凋亡情況。
　　結果:
　　1.通過熒光實時定量PCR檢測，發(fā)現(xiàn)KIAA1529基因在肺癌，乳腺癌及卵巢癌細胞系中均有表達。通過蛋

9、白質(zhì)印跡法檢測，發(fā)現(xiàn)KIAA1529基因編碼蛋白KA在卵巢癌SKOV3、A2780、C13K及OV2008細胞系中均有表達。在卵巢病變組織中，良性病變組織中KA的表達高于惡性腫瘤組織，并且在惡性病變組中，低分化腫瘤組織中KA比高分化及中分化的腫瘤組織中表達明顯降低。
　　2.蛋白質(zhì)印跡法檢測提示，GSK-3β特異性抑制劑LiCl能明顯增加p-GSK-3β蛋白的表達。同時LiCl及紫杉醇共同處理組，比單獨使用紫杉醇處理組KA蛋白的表

10、達明顯升高。流式細胞儀檢測結果顯示，使用GSK-3β特異性抑制劑LiCl后能減弱紫杉醇對卵巢癌SKOV3細胞的G2/M期阻滯，同時有絲分裂指數(shù)降低。通過免疫熒光技術觀察，SKOV3細胞在LiCl與紫杉醇共同作用下，相對于單用紫杉醇處理，阻滯于有絲分裂狀態(tài)的細胞比例明顯減少；同時出現(xiàn)細胞分裂期濃縮核結構及圓形細胞骨架結構的細胞比例明顯減少。流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)LiCl與紫杉醇共同作用組，凋亡率較單用紫杉醇處理組降低。兩組差異均有統(tǒng)計學意義。

11、
　　3.熒光實時定量PCR及蛋白質(zhì)印跡法結果顯示，轉染KA siRNA后，卵巢癌SKOV3細胞中KA的mRNA與蛋白的表達顯著下調(diào)，對KA表達的抑制效果明顯。通過流式細胞儀檢測，同樣在LiCl與紫杉醇的作用下，轉染組G2/M期阻滯較對照組明顯，同時有絲分裂指數(shù)升高。通過免疫熒光技術觀察，在LiCl與紫杉醇共同作用下，轉染組阻滯于有絲分裂狀態(tài)的細胞比例升高；通過對α-tubulin的熒光染色發(fā)現(xiàn)，相對于對照組，轉染組出現(xiàn)細胞分裂期

12、濃縮核結構及圓形細胞骨架結構的細胞比例明顯升高。且流式細胞儀檢測，與對照組相比，轉染組細胞凋亡率明顯升高。組間差異均有明顯統(tǒng)計學意義。
　　4.使用GSK-3β特異性抑制劑LiCl后，在紫杉醇作用下，蛋白質(zhì)印跡法檢測有絲分裂紡錘體檢測點相關蛋白Aurora A、Aurora B、BUBR1、MAD2、CDC20，結果顯示使用GSK-3β特異性抑制劑LiCl后，在紫杉醇作用下，MAD2及CDC20的表達無明顯變化，僅有Aurora

13、A、Aurora B、BUBR1蛋白出現(xiàn)相應的表達變化。在LiCl與紫杉醇共同作用下，相對于單用紫杉醇，Aurora A、Aurora B、BUBR1蛋白的表達均下調(diào)。轉染KA siRNA后，在LiCl與紫杉醇的聯(lián)合作用下，轉染組與對照組相比，Aurora A與BUBR1蛋白的表達無明顯改變，而Aurora B蛋白表達在轉染組抑制KA表達后上調(diào)。
　　5.蛋白質(zhì)印跡法結果顯示，轉染Aurora B siRNA后，卵巢癌SKOV3細

14、胞中Aurora B蛋白的表達顯著下調(diào)，對Aurora B表達的抑制效果明顯。流式細胞儀檢測結果表明，單用紫杉醇處理后，相對于對照組，轉染組細胞有絲分裂指數(shù)下降。免疫熒光染色結果顯示，與對照組相比較，轉染組處于有絲分裂狀態(tài)的細胞減少，同時轉染組出現(xiàn)細胞分裂期濃縮核結構及圓形細胞骨架結構的細胞比例明顯減少。經(jīng)流式細胞儀檢測，相對于對照組，轉染組轉染Aurora B siRNA后，在紫杉醇的作用下，凋亡率下降。
　　結論:
　　

15、新基因KIAA1529編碼及其編碼蛋白KA在卵巢癌細胞系中均有不同程度的表達。在卵巢病變組織中發(fā)現(xiàn)的KA表達差異顯示，新基因KIAA1529編碼蛋白KA與卵巢癌的分化有密切關系。
　　在GSK-3β信號通路中，通過GSK-3β特異性抑制劑LiCl作用于卵巢癌SKOV3細胞，使細胞中的GSK-3β磷酸化從而達到抑制GSK-3β的效果。當細胞中的GSK-3β通過磷酸化被抑制后，在紫杉醇的作用下，SKOV3細胞中KA蛋白的表達升高，同時

16、出現(xiàn)紫杉醇所誘導的卵巢癌SKOV3細胞G2/M期阻滯的效應減弱，使腫瘤細胞從紫杉醇所誘導的有絲分裂阻滯狀態(tài)中逃逸，最終紫杉醇誘導的卵巢癌腫瘤細胞凋亡減少，從而產(chǎn)生對紫杉醇的耐藥。
　　而當通過RNA干擾技術抑制KA蛋白的表達后，逆轉了上述通過LiCl磷酸化抑制GSK-3β產(chǎn)生的卵巢癌SKOV3細胞的紫杉醇耐藥現(xiàn)象。說明通過磷酸化抑制GSK-3β所出現(xiàn)的卵巢癌細胞對紫杉醇耐藥機制，可能是通過新基因編碼蛋白KA的表達升高產(chǎn)生的。

17、>　　實驗進一步證實，GSK-3β通過LiCl磷酸化被抑制后，在紫杉醇的作用下KA表達升高的同時，抑制了染色體過客蛋白復合物之一Aurora B蛋白的表達；而當通過RNA干擾技術抑制KA蛋白的表達，Aurora B蛋白的表達恢復。說明了KA表達的升高抑制了染色體過客蛋白Aurora B的表達，破壞了有絲分裂紡錘體檢測點的功能，從而使細胞逃逸了紫杉醇誘導的有絲分裂阻滯，造成卵巢癌腫瘤細胞對紫杉醇的耐藥。
　　綜上所述，本實驗首次在卵