高羊茅離體培養(yǎng)再生體系的優(yōu)化及農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、病害是遏制當今草坪業(yè)健康發(fā)展的主要因素，高羊茅(Festuca arundinaceaSchreb.)是一種優(yōu)良的冷季型草坪草，由于它具有抗干旱、耐瘠薄、耐踐踏、綠期長、適應性廣等特點，在城市綠化和運動場地的建設(shè)中被廣泛運用。但有些品種抗病性差，如對褐斑病和銹病等真菌病害較為敏感，嚴重制約了其草坪質(zhì)量和景觀。運用基因工程培育抗病品種能夠解決傳統(tǒng)育種中效率低、周期長的難題。溶菌酶具有幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶的雙重活性，能分解細菌和真菌細胞壁組分

2、多糖的β-1，4糖苷鍵，從而裂解病原菌來抵抗病菌的入侵。 該研究以目前廣泛運用的獵狗五號(HuntdogV)、交戰(zhàn)二號(C：rOSSfireⅡ)、德米尼(Deminion)、王朝(Dynasty)、新秀(Xinxiu)五個高羊茅新品種的成熟種子為試驗材料，優(yōu)化了其愈傷組織再生體系，初步建立了根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系，為利用基因工程手段改良高羊茅品種奠定了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下： 1.建立了高羊茅愈傷組織再生體系 (1)

3、首次系統(tǒng)地比較了高羊茅六種外植體即成熟種子、去胚乳種子、去種皮種子、胚軸、幼根、幼葉對愈傷組織誘導和分化的影響。研究表明：不同外植體對愈傷組織的誘導和分化差異顯著。誘導時以去胚乳種子為最佳外植體，其誘導率平均為76.5％遠遠高于其它外植體，種子切除胚乳后誘導率比完整種子提高了27.8％。而分化時胚軸愈傷組織分化率(86.25％)高于去胚乳種子(81.32％)，但胚軸的剝離費時、費力。 (2)以各品種的去胚乳種子為外植體，研究了M

4、S、改良MS(MSM)(MS無機鹽+水解酪蛋白1mg/L+VB<,1>9.9mg/L+VB<,6>9.5 mg/L+尼克酸4.5mg/L)、CC、NB四種基本培養(yǎng)基對愈傷組織誘導、繼代和分化的影響。結(jié)果表明：MSM是愈傷組織誘導的最佳基本培養(yǎng)基，誘導率達到80％～92.5％。但分化時卻以MS為最佳，在MS+2.5 mg/L KT+2 mg/L6-BA上，五個品種分化率為66.8％～89.5％，其中以交戰(zhàn)二號的分化率最高。 (3)

5、本研究探討了外源激素種類及濃度的配比對愈傷組織誘導和植株再生的影響。結(jié)果表明：高羊茅愈傷組織誘導需要較高的2，4-D濃度，多數(shù)品種以9 mg幾為最佳，添加0.5～1mg/L ABA對發(fā)芽和愈傷組織誘導有強烈抑制作用，出愈率最低為15％。繼代培養(yǎng)基中降低2，4-D濃度同時添加0.02～0.1mg/L KT，能顯著促進胚性愈傷組織的發(fā)生，兩者最佳組合為5mg/L2，4-D+0.1mg/L KT。KT與6-BA配合使用對愈傷組織分化有增效作用

6、，分化率最高達89.5％，最佳組合為2.5 mg/L KT+2 mg/L6-BA。 另外，試驗發(fā)現(xiàn)，高羊茅不同品種之間愈傷組織誘導、繼代和分化培養(yǎng)中存在明顯差異，說明對品種進行選擇是必要的。 2.進行了農(nóng)桿菌介導的高羊茅轉(zhuǎn)基因研究 本研究初步建立了以愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體的根癌農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化體系，首次將抗病原菌溶菌酶基因?qū)肓烁哐蛎?。研究結(jié)果表明：選擇初次繼代20d的胚性愈傷組織，用菌液濃度OD<,600>≈0