人T細胞免疫球蛋白黏蛋白與凋亡細胞的相互作用研究.pdf

1、第一部分人TIM-1和TIM-3 Mrna 實時SYBR Green I 定量RT-PCR檢測方法的建立
　　 目的：建立實時SYBR Green I 定量RT-PCR檢測人TIM-1和TIM-3 Mrna的方法。
　　 方法：從人外周血單個核細胞提取的總RNA中逆轉錄擴增人TIM-1和TIM-3的Cdna,將將純化的人TIM-1和TIM-3的擴增產(chǎn)物分別與Pmd18-T Simple 載體進行連接，轉化宿主菌DH5α，

2、提取重組質(zhì)粒DNA，PCR鑒定并測序分析。純化質(zhì)粒并檢測260 nm 吸光值，確定重組質(zhì)粒原液的拷貝濃度并以此制備熒光定量PCR梯度濃度標準品，進行實時熒光定量PCR實驗。
　　 結果：建立了TIM-1和TIM-3基因基因Mrna表達實時熒光定量PCR檢測方法，檢測靈敏度達103 拷貝，線性范圍為103 ～107 拷貝。閾值循環(huán)數(shù)(Ct）與PCR體系中起始模板量的對數(shù)值之間有著良好的線性關系，線性相關系數(shù)分別為1.00和1.00

3、，擴增效率分別為1.070和1.023，批內(nèi)及批間變異系數(shù)<5％。熔解曲線分析表明，產(chǎn)物為特異的單峰。
　　 結論：成功建立檢測人TIM-1和TIM-3的實時熒光定量PCR方法，為進一步研究人TIM-1和TIM-3 功能奠定基礎。
　　 第二部分人T細胞免疫球蛋白粘蛋白基因家族及其融合蛋白真表達載體的構建和生物信息學分析
　　 目的：分別構建人T細胞免疫球蛋白粘蛋白基因3成員及其融合蛋白真核表達載體，并對TIM基

4、因家族3個成員進行生物信息學分析。
　　 方法：采用Trizol法從人外周血單個核細胞提取總Mrna，利用兩步法RT-PCR技術擴增TIM基因家族3個成員及其胞外(結構)域基因片段和人IgG1 Fc基因片段。并將它們分別克隆到真核表達載體pcDNA3.1（+）中,通過PCR及測序進行鑒定。序列分析后將TIM-3胞外(結構)域基因片段亞克隆到已經(jīng)克隆了人IgG1 Fc基因片段真核表達載體pcDAN3.1(+)上；并通過PCR及雙酶

5、切進行鑒定。并應用生物信息學初步分析TIM基因家族的物理化學性質(zhì)、蛋白質(zhì)結構域、功能。
　　 結果：成功從PBMC中提取并逆轉錄的Cdna擴增出TIM基因家族3個成員及其胞外(結構)域基因和人IgG1 Fc基因；經(jīng)PCR、酶切鑒定、測序分析表明它們與GenBank提供的序列信息完全相同。生物信息學分析結果表明TIM-1蛋白為不穩(wěn)定親水性蛋白，有1個跨膜螺旋結構，相對分子量是39.2KD,等電點Pi為6.44。該蛋白含約23.08

6、％的α–螺旋，29.67％的延伸鏈，47.25％的不規(guī)則卷曲，1段20個氨基酸組成的信號肽。TIM-1蛋白亞細胞定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、細胞膜上。功能分析預測TIM-1蛋白具有受體、信號轉導、免疫應答功能。TIM-3蛋白為穩(wěn)定親水性蛋白，有1個跨膜螺旋結構，相對分子量是33.4KD,等電點Pi為5.54。該蛋白含約32.56％的α–螺旋，8.27％的延伸鏈，49.17％的不規(guī)則卷曲，1段21個氨基酸組成的信號肽。TIM-3蛋白亞細胞定位

7、于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、液泡、細胞膜上。功能分析預測TIM-3蛋白具有受體和信號轉導功能。TIM-4蛋白為不穩(wěn)定親水性蛋白，有1個跨膜螺旋結構，相對分子量是41.6KD,等電點Pi為5．75。該蛋白含約10.32％的α–螺旋，29.89％的延伸鏈，59.79％的不規(guī)則卷曲，1段24個氨基酸組成的信號肽。TIM-4蛋白亞細胞定位于細胞質(zhì)、細胞核、分泌系統(tǒng)的小囊泡、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體上。功能分析預測TIM-4蛋白具有受體和信號轉導功能。<

8、br>　　 結論：成功構建TIM基因家族成員及其融合蛋白真核表達載體，并利用生物分析軟件對其進行生物信息學分析。了解TIM基因家族成員的性質(zhì)特征，為進一步研究該基因家族奠定基礎。
　　 第三部分人T細胞免疫球蛋白黏蛋白與凋亡細胞的相互作用研究
　　 目的：為了研究人T細胞免疫球蛋白粘蛋白基因家族與凋亡細胞之間的相互作用，以進一步探討TIM基因家族在細胞凋亡中作用。
　　 方法：構建含人TIM基因三個成員不同長度

9、片段的9種Pegfp-N1真核表達載體及其Ig融合蛋白表達載體。將這些構建的真核表達載體瞬時轉染CHO細胞，并收集上清液。直接采用TIM-EGFP融合蛋白與PI為探針，檢測TIM蛋白與凋亡細胞的相互作用。
　　 結果：人TIM基因家族的3個蛋白都能直接識別和結合凋亡細胞，而與活細胞不能結合。并且，Stim-1-EGFP、Stim-3-EGFP和Stim-4-EGFP融合蛋白與凋亡細胞之間的相互作用被相應的TIM-1-Ig、TIM

10、-3-Ig和 TIM-4-Ig所阻止。而且，結果表明人TIM基因家族的3個蛋白通過其IgV區(qū)直接識別和結合凋亡細胞。
　　 結論：人TIM基因家族的3個蛋白充當?shù)蛲黾毎氖荏w，可能在細胞凋亡調(diào)控中起重要作用。人TIM蛋白可以作為新的蛋白用于細胞凋亡的檢測。
　　 第四部分人TIM-EGFP 融合蛋白的在大腸桿菌中的表達和特征的研究
　　 目的：為了探討人TIM-EGFP融合蛋白在大腸桿菌中的表達和純化，并評價它們

11、的生物活性。
　　 方法：采用PCR分別擴增人TIM基因家族3成員和EGFP片段，并且將它們克隆至原核表達載體Pet-28a中。構建的重組質(zhì)粒Pet-28a-TIM-EGFP分別轉化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導表達TIM-EGFP融合蛋白。表達的融合蛋白經(jīng)Ni-NTA樹脂純化，并且通過熒光顯微鏡檢測它們與凋亡細胞的結合活性。
　　 結果：分別成功構建人TIM-1-EGFP、TIM-3-EGFP和TIM-4-

12、EGFP的融合蛋白表達載體，并在大腸桿菌中表達。結果證明TIM-EGFP融合蛋白3個成員都能直接識別和結合凋亡細胞，而與活細胞不能。更進一步證實TIM-4-EGFP與凋亡細胞的相互作用可以被相應的TIM-Ig融合蛋白阻止。
　　 結論：分別成功構建人TIM-1-EGFP、TIM-3-EGFP和TIM-4-EGFP的融合蛋白表達載體，并在大腸桿菌中表達。據(jù)所知，這是目前首次在大腸桿菌中表達TIM基因家族的3個成員。結果也表明人TI