LC-MS-MS法和微生物法在評價地紅霉素生物等效性中的差異.pdf

1、地紅霉素是基于紅霉素結構改造而產生的新一代14元大環(huán)內酯類抗生素，系紅霉胺的前體藥物，目前研究地紅霉素生物等效性方法主要有兩種類型：分子濃度法和生物效應法，前者適用于單一化學成分的體內生物等效性研究，后者適用于多組分研究，且具有相似的生物效應。由于研究對象的不同，兩種研究方法在評價藥物生物等效性中可能存在差異。LC-MS/MS（簡稱質譜法）與微生物法為兩種類型的代表方法，本文采用質譜法與微生物法兩種研究方法測定健康受試者單劑量口服地紅霉

2、素500mg后血藥濃度，分別研究地紅霉素生物等效性，并研究兩種方法在評價地紅霉素生物等效性中的是否存在差異。
　　 第一部分 LC-MS/MS測定人血漿中紅霉胺的分析方法
　　 目的：本試驗旨在建立LC-MS/MS法測定血漿中紅霉胺的濃度，研究地紅霉素的人體藥代動力學和生物等效性。
　　 方法：本試驗采用LC-MS/MS法測定血漿中紅霉胺的濃度。以Restek Allure C18（4.6×50mm，5.0μm）

3、色譜柱為分析柱，流動相為甲醇：0.5％甲酸水溶液（50：50，v/v），流速0.5mL/min，進樣量10μL，柱溫20℃。質譜條件為電噴霧離子源，噴霧電壓為5500V，霧化溫度為550℃，霧化氣為30L/min，簾氣為20L/min，碰撞氣為12L/min；正離子多離子反應監(jiān)測，用于定量分析的離子反應分別為m/z735.7→m/z577.5（紅霉胺），m/z282.2→m/z212.2（酚妥拉明），碰撞誘導解離電壓分別為36V（紅霉胺

4、）和27V（酚妥拉明）；駐留時間為200ms。采用固相萃取進行血樣處理。對方法特異性、線性和定量下限、精密度和準確度、樣品穩(wěn)定性、提取回收率和基質效應等方面進行方法學確證。
　　 結果：在本試驗建立的分析條件下，通過正離子多離子反應監(jiān)測，方法特異性更強，血漿中其它內源性雜質不干擾測定。在所選擇色譜、質譜條件下，紅霉胺與內標分離效果良好，離子響應穩(wěn)定且靈敏，保留時間合適，無明顯基質效應。本法的線性范圍為5.0-1000.0ng/m

5、L，相關系數在0.9977-0.9994之間，典型回歸方程為：v=1.18×100x-1.49×10-3r=0.9991（n=6）；定量下限為5.0ng/mL；本法測定低、中、高（10.0、100.0、800.0ng/mL）3個血漿樣品中紅霉胺的濃度，日內RSD≤4.8％、日間RSD≤4.6％，RE≤7.6％；低、中、高紅霉胺血漿樣品的提取回收率分別為91.7％、96.3％和93.0％，內標血漿樣品的提取回收率為92.1％（n=9）；樣

6、品在避光條件下室溫放置4h，預處理后室溫放置24h，經3次凍融循環(huán)及凍存60d的穩(wěn)定性良好，RSD均≤4.2％。
　　 結論：采用固相萃取技術處理血樣，LC-MS/MS法測定血漿中紅霉胺的濃度，完全可以滿足方法學要求，專屬性強，靈敏度高，穩(wěn)定性好，可以準確的測定人血漿樣品中的紅霉胺，可用于地紅霉素制劑的藥代動力學和生物等效性研究。
　　 第二部分 LC-MS/MS法研究地紅霉素腸溶片的生物等效性
　　 目的：研究

7、健康受試者口服地紅霉素腸溶片500mg后，其主要代謝物紅霉胺在人體內的藥代動力學特征，并根據受試藥物和參比藥物的主要藥代動力學參數統(tǒng)計分析結果判定兩制劑是否具有生物等效性。
　　 方法：20名受試者隨機分為2組，按雙周期二交叉設計試驗，每組受試者前后兩次隨機空腹口服受試藥物和參比藥物，于間隔期后兩組互換，兩次試驗周期間隔時間為14日。分別在服藥前取空白血樣，于服藥后1.5，2，3，4，5，6，8，10，12，24，48，72，9

8、6h各個時刻采集14個血樣，試驗所得紅霉胺血藥濃度數據用DAS2.0程序軟件計算藥代動力學參數，數據處理方法用逐個受試者的血藥濃度-時間數據作曲線擬合，求得個體參數后計算平均值。采用DAS2.0統(tǒng)計軟件對各制劑所得的主要藥代動力學參數Cmax、AUC值進行方差和生物等效性統(tǒng)計，Cmax和 Tmax為實測值，Cmax及AUC值經對數轉換后作雙單側t檢驗，Tmax用非參數法分析。
　　 結果：在測定樣品過程中，質控樣品包含低、中、高

9、三個濃度（10.0、100.0、800.0ng/mL）共45個，超過總樣品的5％，且RE均小于15％，所有批次樣品測定結果符合方法學要求；采用AIC判斷法房室模型，權重系數取1/C2，取最小值，經模擬各受試者血藥濃度數據，大部分受試者符合二房室模型方程，此模型下兩制劑部分參數如t1/2α、t1/2β、t1/2Ka等無明顯差異，表明兩制劑的藥物代謝過程基本相同；消除半衰期按t1/2=0.693/Zeta計算，藥時曲線下面積（AUC）由梯形

10、法求得，受試藥物和參比藥物主要藥代動力學參數分別為：34.6和33.1h（消除半衰期）、4.4和4.7h（Tmax）、249.2和265.9ng/mL（Cmax）、3063.0和3166.5ng/mL·h（AUC0-96h）、3480.6和3561.8ng/mL·h（AUC0-∞）；紅霉胺Cmax[1n]、AUC0-96h[1n]和AUC0-∞[1n]值多因素方差分析結果表明，個體間有顯著性差異（P<0.05），制劑間及周期間均無顯著性

11、差異（P>0.05），Cmax、AUC0-96h、AUC0-∞雙向單側t檢驗結果表明受試制劑Cmax的90％可信限落在參比制劑70％-143％之間，受試藥物AUC的90％可信限落在參比藥物80％-125％之間；經檢驗受試藥物和參比藥物符合等效標準，具有生物等效性。
　　 結論：本試驗主要藥代動力學參數與參考文獻報道基本一致，通過20名健康受試者隨機單次口服受試藥物地紅霉素腸溶片（T）與參比藥物地紅霉素腸溶片（R）的交叉試驗，經統(tǒng)

12、計分析證明兩藥物具有生物等效性。受試藥物相對于參比藥物的紅霉胺相對生物利用度為100.7±21.7％。LC-MS/MS測定方法在樣品測定過程中耐用性好，結果準確可靠，可保證大批量生物樣品在短時間內完成測定。
　　 第三部分微生物法研究地紅霉素生物等效性及其與LC-MS/MS法評價地紅霉素生物等效性中的差異
　　 目的：本試驗通過微生物法測定口服兩種地紅霉素制劑500mg后不同時間的血樣濃度，并與LC-MS/MS法測定結果

13、進行比較，研究兩種測定方法在評價地紅霉素生物等效性方面是否存在差異。
　　 方法：以藤黃微球菌為檢定菌，采用抗生素Ⅱ號培養(yǎng)基（pH7.9±0.1）。對分析方法特異性、線性和定量下限、精密度和準確度、樣品穩(wěn)定性等方面進行方法學確證。20名健康受試者口服單劑量500mg受試藥物和參比藥物后，測定紅霉胺不同時間血藥濃度。試驗所得紅霉胺血藥濃度數據用DAS2.0程序軟件計算藥代動力學參數，數據處理方法用逐個受試者的血藥濃度-時間數據作曲

14、線擬合，求得個體參數后計算平均值。經F檢驗判斷兩組結果是否具有方差齊性，對方差齊者采用組間t檢驗，判別質譜法和微生物兩種方法測定結果之間是否具有顯著性差異。
　　 結果：空白血漿無明顯抑菌圈，空白血中其他成分不干擾微生物法的測定。線性范圍為15.0～500.0ng/mL，相關系數在0.9967-0.9985之間，典型回歸方程為：y=13.86541gC-6.0765，r=0.9978（n=6），定量下限為15.0ng/mL。本法

15、測定30.0、100.0、500.0ng/mL3個血漿樣品中紅霉胺的濃度，日內RSD分別為8.0％、6.0％和4.8％，日間RSD分別為10.0％、11.2％和8.2％，方法回收率分別為110.5％、103.7％和106.6％，樣品凍存90d的穩(wěn)定性良好，RSD均不大于5.0％。T和R主要PK參數分別為：30.96和31.29h（t1/2）、4.4和4.7h（Tmax）、256.5和268.3ng/mL（Cmax）、3026.8和308

16、0.0ng/mL·h（AUC0-96h）、3669.3和3728.8ng/mL·h（AUC0-∞）。紅霉胺Cmax[1n]、AUC0-96h[1n]和AUC0-∞。[1n]值多因素方差分析結果表明，個體間有顯著性差異（P<0.05），制劑間及周期間均無顯著性差異（P>0.05），Cmax、AUC0-96h、AUC0-∞。雙向單側t檢驗結果表明受試制劑Cmax的90％可信限落在參比制劑70％-143％之間，受試藥物AUC的90％可信限落在

17、參比藥物80％-125％之間；經檢驗受試藥物和參比藥物符合等效標準，具有生物等效性。兩種方法在評價地紅霉素生物等效性方面無明顯差異。
　　 結論：20名健康志愿者口服地紅霉素腸溶片500mg后，微生物法和質譜法在評價地紅霉素生物等效性中無明顯差異，受試藥物相對于參比藥物的紅霉胺相對生物利用度為104.9±32.8％；地紅霉素在人體吸收過程中，微生物法測得的血藥濃度明顯高于質譜法，主要原因是微生物法測定包括地紅霉素和紅霉胺兩者的總