單克隆抗體ZUC3免疫磁珠分選人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法研究.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MesenchymalStemCells，MSCs)是骨髓組織中除造血干細(xì)胞外的一種非造血組織的成體干細(xì)胞。MSCs具有自我更新、高度增殖及多向分化的能力，在一定的體內(nèi)或體外誘導(dǎo)條件下可以分化為各個(gè)胚層的細(xì)胞，如脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、肌腱細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、上皮細(xì)胞等。本研究組以人骨髓MSCs為抗原免疫BALB/C小鼠，采用雜交瘤技術(shù)成功制備了一株新的抗人骨髓MSCs單克隆抗體，命名為ZUC3，抗體亞型

2、為IgM，并已證實(shí)其對人骨髓MSCs有高度的特異性。本研究將應(yīng)用單克隆抗體ZUC3，通過正向免疫分選的方法從人骨髓單個(gè)核細(xì)胞中分離純化原代MSCs，進(jìn)一步鑒定ZUC3抗原陽性MSCs在體外培養(yǎng)擴(kuò)增、多向分化的潛能，以初步探討一種較理想的人骨髓MSCs原代細(xì)胞的分離純化方法。本研究首先將抗人骨髓MSCs單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株ZUC3復(fù)蘇并擴(kuò)增，以每只小鼠1.0×106細(xì)胞接種于經(jīng)液體石蠟預(yù)處理過的BALB/C小鼠腹腔，誘生腹水。收集腹水，

3、采用鹽析法純化腹水抗體。經(jīng)間接免疫熒光染色法測定抗體效價(jià)為1∶104。以單克隆抗體ZUC3為探針，通過流式細(xì)胞儀分析顯示ZUC3抗原在人骨髓MSCs、人骨髓單個(gè)核細(xì)胞、人外周血單個(gè)核細(xì)胞中的陽性率分別為91.31±2.92％、0.96±0.28％、0.24±0.05％，通過間接免疫熒光染色法證實(shí)單克隆抗體ZUC3與被檢的骨髓來源的8個(gè)細(xì)胞株(HL-60、NB4、K562、U-937、HEL、Jurkat、Raji、KM3)均無交叉反應(yīng)。

4、結(jié)果提示單克隆抗體ZUC3與人骨髓MSCs表面抗原結(jié)合，有高度特異性，可作為細(xì)胞分選的免疫標(biāo)記。 為鑒定從人骨髓單個(gè)核細(xì)胞中分選獲得的ZUC3抗原陽性細(xì)胞的多向分化潛能，本研究應(yīng)用脂肪誘導(dǎo)分化劑(StemCellInc.)和成骨誘導(dǎo)分化劑(10-8M地塞米松，10mMβ磷酸甘油，0.2mM抗壞血酸，10％(V/V)FBS的LG-DMEM培養(yǎng)液)成功誘導(dǎo)ZUC3抗原陽性細(xì)胞向成脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化。經(jīng)成脂肪誘導(dǎo)劑培養(yǎng)后，油紅O染

5、色觀察到大量橙紅色脂肪細(xì)胞；經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)1周后出現(xiàn)方形或多角形細(xì)胞以及鈣化結(jié)節(jié)，培養(yǎng)20天后VonKossa法染色，可見染成棕黑色的細(xì)胞外基質(zhì)鈣鹽沉積。提示以單克隆抗體ZUC3為標(biāo)記，通過正向免疫分選的ZUC3抗原陽性細(xì)胞具有多向分化潛能，可以在體外誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞。綜上所述，本研究得出以下結(jié)論： 1.單克隆抗體ZUC3與人骨髓MSCs表面抗原結(jié)合，有高度特異性，可作為細(xì)胞分選的免疫標(biāo)記。 2.單克隆抗體Z

6、UC3間接免疫磁珠正向分選法可有效地從人骨髓單個(gè)核細(xì)胞中分離獲得ZUC3抗原陽性細(xì)胞，且分選細(xì)胞具有較好的活力，可在體外培養(yǎng)。 3.單克隆抗體ZUC3間接免疫磁珠分選法獲得的ZUC3抗原陽性細(xì)胞體外培養(yǎng)，原代細(xì)胞貼壁呈梭形、集落樣分布，細(xì)胞形態(tài)均一，與成纖維細(xì)胞形態(tài)相似，排列成漩渦狀、輻射狀；細(xì)胞傳代后生長迅速，增殖快，具有很好的增殖活性。分選獲得的ZUC3抗原陰性細(xì)胞僅見少量的貼壁細(xì)胞，不具有增殖能力。4.ZUC3抗原陽性細(xì)胞

7、在體外傳代培養(yǎng)后表面分子CD29、CD44、CD105、CD166陽性，而造血細(xì)胞分化抗原CD14、CD34、CD45、HLA-DR表達(dá)均為陰性，是一均質(zhì)的細(xì)胞群，不含造血細(xì)胞。 5.ZUC3抗原陽性細(xì)胞具有多向分化潛能，可以在體外誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞。 6.從人骨髓單個(gè)核細(xì)胞中分離獲得的ZUC3抗原陽性細(xì)胞具有體外擴(kuò)增、多向分化的潛能及MSCs典型的表型特征，單克隆抗體ZUC3免疫磁珠分選人骨髓MSCs可以做為