落新婦甙對肝臟熱缺血再灌注損傷保護作用的分子機制研究.pdf

1、肝移植已經成為治療多數(shù)急、慢性終末期肝病的首選方法。但是存在于每一例肝移植過程中的缺血再灌注損傷(IRI)仍然是原發(fā)性移植物功能不良或無功能的主要原因。供體的短缺使得移植中心不斷擴大使用邊緣供體的尺度,包括老齡供體、無心跳供體、小體積供肝及脂肪肝。而邊緣供體帶來的基本問題仍然是IRI。因此,最大限度的減輕IRI不但可以增加適當?shù)墓w,也可以使更多的病人從肝移植手術中康復。而實現(xiàn)這一愿望的首要步驟就是更加充分的理解I/R損傷的機制。

2、 肝臟是對缺血再灌注損傷最敏感的器官之一。肝竇內皮細胞、Kupfer cells和中性粒細胞的活化以及氧自由基的產生在缺血再灌注損傷的病理過程中具有重要作用。氧自由基和炎癥細胞因子、粘附分子進一步促進中性粒細胞的活化與聚集,介導脂質過氧化損傷等過程,最終導致肝組織損傷。 1997年發(fā)現(xiàn)的Toll樣受體系統(tǒng)(TLRs)在感染和炎癥性疾病中扮演重要角色。其中的TLR-4信號通路被認為在心臟、腎臟和肝臟的IRI病理生理過程中居主導地

3、位。TLR-4分子存在于所有肝實質、非實質細胞上,每種肝細胞群體都擁有完整的TLR-4信號通路。激活的肝臟非實質細胞(尤其Kupffer細胞)通過TLR-4信號通路在肝臟熱缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用。TLR-4的激活引出NF-κB激活,進一步觸發(fā)TNF-α、IL-I、IL-6等炎癥因子的大量產生。因為TLR-4信號通道在肝臟缺血再灌注損傷中的重要作用,通過抑制該信號通路達到減輕肝臟IRI的目的就顯得前景誘人。HO-1是熱休克蛋白32成

4、員,肝臟HO-1最初由Kupffer細胞產生,作為TLR-4的配體之一,通過阻抑TLR-4信號通路產生較強的抗氧化、抗炎癥功能從而起到保護肝臟IRI的作用。。 另一方面,細胞因子信號轉導抑制分子1(Supressors of cytokine signaling1,SOCS1)是一種負性調節(jié)因子。能通過負性調控JAK-STAT信號途徑而抑制ILs、IFN-γ、GH等多種細胞因子的信號轉導途徑。SOCS1還參與其它信號途徑的調節(jié),

5、如TNF-a、LPS等。SOCS1的過表達在體外能明顯減輕TNF-a引起的肝細胞凋亡,而TNF-a被認為是TLR-4活化的標志。提示SOCS1可能是負調節(jié)TLR-4及其信號轉導系統(tǒng)的內源性因子之一。研究顯示IL-10能夠促進SOCS蛋白的產生,尤其是SOCS1和SOCS3。研究者在包括肝臟的許多缺血再灌注損傷模型中都能觀察到IL-10的抑制炎癥、保護組織的作用。因此如有藥物能促進體內IL-10表達,則可能通過SOCS1負調節(jié)信號通道在肝

6、臟IRI中發(fā)揮保護作用。落新婦甙(Astilbin)是從土茯苓的乙醇提取液中分離得到的3個二氫黃酮醇甙之一。黃酮類化合物有較強的抗氧化作用,可作為遞氫體清除氧自由基,從而在抗炎、減輕缺血再灌注損傷等方面發(fā)揮作用。研究證實其具有利尿、鎮(zhèn)痛、抗炎及減輕心肌細胞缺血再灌注損傷的作用。有研究報道落新婦甙能夠通過干預氧自由基和脂質過氧化物生成,明顯減輕四氯化碳(CC14)引起的肝損傷：在刀豆球蛋白A(Con A)誘導肝炎后,落新婦甙能夠顯著降低T

7、NF-a的生成和肝臟Kupffer細胞的增殖,并且落新婦甙在接觸性皮炎模型中能顯著促進IL-10和SOCS1和SOCS3的表達,減輕炎癥反應。 基于上述研究背景,本課題進一步研究：1)落新婦甙對肝臟熱缺血再灌注損傷的保護效果,包括肝功能、肝臟病理、SOD、MDA、MPO的檢測；2)落新婦甙對肝臟缺血再灌注損傷模型中TLR-4、HO-1、NF-κB、TNF-a等分子蛋白和mRNA水平表達的影響,探討其抑制炎癥信號通路的分子機制；3

8、)落新婦甙對IL-10、SOCS1蛋白和mRNA表達的影響,探討其促進抑炎信號通路的分子機制。通過上述研究,為以后在同種異體小鼠肝移植模型中研究落新婦甙對缺血再灌注損傷保護,免疫抑制效果及機制進行基礎準備。 第一部分 落新婦甙對肝臟熱缺血再灌注損傷的干預作用 目的：探討落新婦甙在肝臟熱缺血再灌注損傷中對肝功能和肝組織的保護效果。 方法: C57BL/6小鼠隨機分為4組(n=8)：假手術組(Sham)、模型組(I

9、/R)、落新婦甙小劑量(10mg/kg)干預組和落新婦甙大劑量(40mg/kg)干預組。缺血前24小時和1小時干預組小鼠腹腔注射分別給予10或40mg/kg的落新婦甙,建立肝左、中葉70％部分肝缺血再灌注模型,模型組和假手術組給予同樣體積的生理鹽水。小鼠肝臟左葉缺血90min、再灌注6h后各實驗組采集血液和肝臟組織樣本。檢測血清中ALT活性作為肝功能損傷的指標,同時用ELISA檢測肝組織中MPO、SOD和MDA含量。肝臟組織病理學檢測。

10、 結果：與模型對照組相比,小、大劑量落新婦甙干預組血清ALT含量均明顯下降(P<0.01),大劑量干預組較小劑量組更明顯(P<0.01);落新婦甙大劑量干預后肝臟組織病理學表現(xiàn)明顯改善；落新婦甙干預后肝組織MPO、MDA含量較模型對照組明顯下降(P<0.01),大劑量干預組較小劑量組更明顯(P<0.01);而SOD含量明顯上升(P<0.01),大劑量干預組較小劑量組明顯(P<0.05)。 結論：落新婦甙干預能有效改善小鼠

11、肝臟熱缺血再灌注損傷引起的肝功能和肝臟病理損害：落新婦甙干預能夠減輕小鼠肝臟熱缺血再灌注損傷后中性粒細胞的聚集浸潤和活化,從而減輕炎癥反應；落新婦甙能減少缺血再灌注后氧自由基的產生,減輕脂質過氧化引發(fā)的組織損傷。 第二部分 落新婦甙對肝缺血再灌注損傷TLR-4信號通路的抑制作用 目的：通過觀察落新婦甙對肝臟熱缺血再灌注損傷中炎癥信號通路的影響,探討其缺血再灌注保護作用的分子機制。 方法:C57BL/6小鼠隨機分

12、為4組(n=5)：假手術組(Sham)、模型組(I/R)、落新婦甙小劑量(10mg/kg)干預組和落新婦甙大劑量(40mg/kg)干預組。缺血前24小時和1小時干預組小鼠腹腔注射分別給予10或40mg/kg的落新婦甙,建立肝左、中葉70％部分肝缺血再灌注模型,模型組和假手術組給予同樣體積的生理鹽水。小鼠肝臟左葉缺血90min、再灌注6h后各實驗組采集血液和肝臟組織樣本。檢測血清中TNF-a活性,Westemblot檢測肝組織中TNF-a

13、、TLR-4、NF-κB和HO-1蛋白含量,半定量RT-PCR檢測上述分子mRNA表達情況。 結果：落新婦甙小、大劑量干預后血清TNF-a含量較I/R對照組均明顯下降(P<0.01),且呈現(xiàn)劑量一效益關系(P<0.01);落新婦甙小、大劑量干預組肝組織中TNF-a、TLR-4、NF-κB蛋白表達與I/R模型對照組比較均漸次降低,與半定量RT-PCR結果相符(小劑量干預組P<0.05;大劑量干預組P<0.01);而落新婦甙小、大劑

14、量干預組肝組織中HO-1蛋白表達與I/R模型對照組比較均漸次升高,亦與半定量RT-PCR結果相符(小劑量干預組P<0.05;大劑量干預組P<0.01)。 結論：落新婦甙干預能降低缺血再灌注損傷引起的血清TNF-a水平升高以及TNF-a蛋白及mRNA在肝組織中的高表達,從而減輕由TNF-a介導的進一步損傷；落新婦甙干預能降低IRI肝組織中TLR-4蛋白、mRNA和NF-κB蛋白的高表達,顯示其對TLR-4炎癥信號通路具有抑制作用。

15、落新婦甙干預能促進IRI肝組織HO-1蛋白和mRNA的表達,顯示其對TLR-4通路的抑制與促進HO-1的表達密切相關。 第三部分 落新婦甙對肝缺血再灌注損傷SOCS1、IL-10表達的影響 目的：通過觀察落新婦甙對肝臟熱缺血再灌注損傷中抑炎癥信號通路的影響,進-步探討其缺血再灌注保護作用的分子機制。 方法:C57BL/6小鼠隨機分為4組：假手術組(Sham)、模型組(I/R)、落新婦甙小劑量(10mg/kg)干

16、預組和落新婦甙大劑量(40mg/kg)干預組。缺血前24小時和1小時干預組小鼠腹腔注射分別給予10或40mg/kg的落新婦甙,建立肝左、中葉70％部分肝缺血再灌注模型,模型組和假手術組給予同樣體積的生理鹽水。小鼠肝臟左葉缺血90min、再灌注6h后各實驗組采集血液和肝臟組織樣本。Westemblot檢測肝組織中SOCS-1、IL-10蛋白含量,半定量RT-PCR檢測上述分子mRNA表達情況。 結果：落新婦甙小、大劑量干預組肝組織