Twist基因表達增強結(jié)腸癌細胞HT-29侵襲轉(zhuǎn)移能力的體內(nèi)研究.pdf

1、目的:本實驗通過建立裸鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型，研究在上調(diào)Twist基因表達后對HT-29結(jié)腸癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，探究Twist基因和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化機制的相關標志物N-cadherin、Vimentin和E-cadherin在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象中的表達及其與結(jié)腸癌進展、轉(zhuǎn)移之間的關聯(lián)。
　　方法:使用重組質(zhì)粒pTracer-CMV/BSD-Twist和陰性對照質(zhì)粒pTracer-CMV/BSD轉(zhuǎn)染并經(jīng)殺稻瘟菌素(Blasticid

2、in)篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人HT-29結(jié)腸癌細胞系。采用脾臟原位注射法建立裸鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型，實驗共分為三組:實驗組（轉(zhuǎn)染上調(diào)Twist表達質(zhì)粒組）、陰性對照組（轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組）、空白對照組（未轉(zhuǎn)染組）。注射30天后獲取各組裸鼠肝臟和脾臟標本，應用熒光實時定量PCR，Western blot和免疫組織化學染色法檢測裸鼠腫瘤組織的Twist和EMT相關分子標志物N-cadherin，Vimentin和E-cadherin的mRNA和蛋白表達

3、情況，并分析各指標的變化。
　　結(jié)果:1.成功建立裸鼠異種結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型，病理檢查結(jié)果符合結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移特點。實驗組脾臟原位腫瘤較陰性對照組及空白對照組大小相近，肝臟轉(zhuǎn)移腫瘤轉(zhuǎn)移灶數(shù)目多于陰性對照及空白對照組，腫瘤大小未見明顯差異。2.實驗組與陰性對照和空白對照組相比，腫瘤組織的Twist，N-cadherin和Vimentin分子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平(9.9082±0.9137，2.431±0.1636，3.0310±0.2026

4、)和蛋白表達水平(0.9916±0.0508，0.9417±0.1025，0.7231±0.0218)明顯升高(P＜0.05);E-cadherin mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平顯著降低（0.4531±0.0536，0.71±0.0613），差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。陰性對照組與空白對照組相比，Twist、N-cadherin、Vimentin和E-cadherin分子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平均無顯著差異(P＞0.0

5、5)。3.Twist基因mRNA表達水平在肝臟轉(zhuǎn)移瘤組織較脾臟原位種植瘤組織中表達升高(P＜0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義。4.免疫組織化學染色結(jié)果顯示實驗組肝、脾臟腫瘤細胞Twist，N-cadherin和Vimentin染色陽性細胞數(shù)多于陰性對照及空白對照組(P＜0.05)，E-cadherin染色結(jié)果顯示實驗組肝、脾臟腫瘤細胞E-cadherin染色少于陰性對照及空白對照組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:1.本研究成功建立裸鼠

6、結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型，其操作安全、成瘤率較高，對結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的基礎與臨床研究均具有應用價值。
　　2.在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染高表達Twist基因質(zhì)粒的HT-29結(jié)腸癌細胞株，通過體內(nèi)實驗，可增強間充質(zhì)標記物N-cadherin，Vimentin mRNA及蛋白的表達水平，降低上皮標志物E-cadherin mRNA及蛋白的表達水平，促進上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，逆轉(zhuǎn)間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化。
　　3.在體內(nèi)實驗中肝臟轉(zhuǎn)移灶腫瘤的Twist基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平