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文檔簡介
1、目的: B細胞是介導(dǎo)抗病毒體液免疫最重要的細胞,在機體的免疫系統(tǒng)中扮演重要角色,B細胞數(shù)量與功能紊亂,直接影響有效的抗病毒免疫應(yīng)答。新近研究發(fā)現(xiàn),B細胞作為適應(yīng)性免疫應(yīng)答細胞,卻表達重要的“天然”模式識別受體—-Toll樣受體(Toll—like receptor,TLR)7與9。TLR7主要識別病毒單鏈RNA(ssRNA);TLR9明確識別的天然配體是CpG—DNA,廣泛存在于細菌和病毒基因組中。TLR7與TLR9信號通路活
2、化決定和影響B(tài)細胞的免疫功能。 目前,對HIV/AIDS患者外周血B細胞數(shù)量變化的研究結(jié)論不甚明確。中國HIV/AIDS患者B細胞數(shù)量變化的研究尚未見報道。HIV/AIDS患者B細胞TLR7與TLR9mRNA表達水平如何,是否在HIV感染進程中發(fā)揮重要作用尚不明確。本文以中國遼寧未經(jīng)高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的HIV/AIDS患者為研究對象,研究HIV/AIDS患者外周血B細胞數(shù)量及B細胞TLR7與TLR9mRNA的表達水平,探討B(tài)細
3、胞數(shù)量及TLR7與TLR9mRNA的表達水平與HIV感染疾病進程的關(guān)系,有助于我們深入了解HIV感染中與B細胞相關(guān)的致病機制,從而為艾滋病疫苗及其佐劑的研發(fā)開辟新徑。 方法: 1、研究對象 1)由中國醫(yī)科大學(xué)艾滋病研究所確認實驗室經(jīng)Western blot試驗確認為HIV陽性的HIV/AIDS患者27例,年齡分布為20~72歲(41.9±13.1歲),未接受抗病毒治療。根據(jù)HIV/AIDS患者感染時間和CD4+T
4、細胞數(shù)量分為典型進展HIV組(HIV組):感染時間>5年,CD4+T細胞數(shù)量≥200個/μl,無艾滋病指征性疾?。坏湫瓦M展AIDS組(AIDS組):感染時間>5年,CD4+T細胞數(shù)<200個/μl,和/或合并艾滋病指征性疾病。 2)16例HIV抗體陰性、未暴露于HIV的健康者為陰性健康對照,性別、年齡與研究對象匹配,年齡分布為25~47歲(35.1±9.3歲)。 3)采集研究對象外周靜脈血10ml。調(diào)查及采血前均征得研究
5、對象同意,并簽署知情同意書。 2、T細胞與B細胞絕對值和比值測定 將20μl CD4/CD8/CD3 TriTEST試劑或20μl CD3/CD16+56/CD45/CD19TriTEST分別加入絕對計數(shù)管中,應(yīng)用逆向加樣法各加入50μl抗凝血,室溫避光15min,加入免洗溶血素450μl,室溫避光15min,F(xiàn)ACS MULTISET軟件檢測并進行自動分析,計算CD4+T細胞、CD8+T細胞與CD19+B細胞絕對值與比
6、值。 3、密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC) 將PBS稀釋后的抗凝全血30ml沿管壁緩慢加至10ml Ficoll PaqueTM Plus淋巴細胞分離液液面上,400g、30min離心。吸取PBMC層移入另一離心管中。補充PBS至45ml,洗滌細胞2次后得到PBMC。 4、CD19+B細胞分選 應(yīng)用MACS磁珠分選系統(tǒng)分選C
7、D19+B細胞,嚴(yán)格按照說明書進行操作。每107PBMC細胞加80μl緩沖液與20μlCD19免疫磁珠,4℃孵育15min,每107細胞加2ml緩沖液洗滌細胞,300g、10 min離心,500μl緩沖液重懸細胞,使用LS柱子進行陽性分選。取106細胞加入20μl CD20-PE室溫避光孵育25分鐘,洗滌后進行流式細胞儀檢測,應(yīng)用Cellquest軟件進行細胞純度分析。 5、提取CD19+B細胞RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA
8、采用Qiagen公司的試劑盒RNeasy mini kit提取CD19+B細胞總RNA。使用紫外分光光度儀檢測RNA濃度及純度。取20μl總RNA,加入2μl Oligo(dT)15配制成RNA/引物混合物22μl,70℃5min熱休克,立即冰上放置5min。用Promega公司的試劑盒ImProm—Ⅱ Reverse Transcription System逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系:ImProm—Ⅱ5×Reaction Bu
9、ffer10μl,MgCl212μl,dNTP2.5μl,Recombinant RNasin() Ribonuclease Inhibitor20U,ImProm—Ⅱ Reverse Transcriptase2.5μl。向RNA/引物混合物中加入上述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系28μl(總體積50μl)。逆轉(zhuǎn)錄條件:25℃5min;42℃1h;70℃15min。所得cDNA于—20℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?6、實時定量PCR 設(shè)計目的基因
10、TLR7、TLR9和內(nèi)參GAPDH特異性引物,由invitrogen公司合成。采用ABI公司的SYBR Green試劑盒,應(yīng)用ABI7500熒光定量PCR儀進行定量檢測。25μl實時PCR反應(yīng)體系:2×Power SYBR() Green PCR Master Mix12.5μl,上下游引物各1μl,cDNA模板2μl,RNase—free water8.5μl。反應(yīng)條件:95℃10min熱啟動,95℃15sec變性、60℃1min退火
11、及延伸40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后進行融解曲線分析引物的特異性。用相對定量2—()()Ct法比較各組間TLR7或TLR9的mRNA相對表達差異。每一份標(biāo)本均行復(fù)管檢測,取其均值做為目的基因的表達水平。 7、統(tǒng)計學(xué)處理 所有資料采用SPSS16軟件分析。數(shù)據(jù)均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析,并進行均數(shù)兩兩比較,使用Pearson進行相關(guān)性分析,不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用Mann—Whitney U test進
12、行比較,使用Spearman rank進行相關(guān)性分析,統(tǒng)計概率采用雙側(cè)檢驗,P<0.05時有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果: 1、中國HIV/AIDS患者外周血T細胞與B細胞絕對計數(shù)檢測結(jié)果 HIV/AIDS患者CD4+T細胞數(shù)量為(348.2±182.3)個/μl,顯著低于健康對照組(821.7±217.8)個/μl,P=0.000;HIV組與AIDS組CD4+T細胞數(shù)量分別為(415.3±154.9)個/μl與(138
13、.6±58.1)個/μl,均顯著低于對照組,P=0.0000。HIV/AIDS患者B細胞數(shù)量為(149.5±40.1)個/μl,顯著低于健康對照組(209.1±102.6)個/μl,P<0.05;其中,HIV組與AIDS組B細胞數(shù)量分別為(152.0±42.2)個/μl與(141.3±33.6)個/μl,均顯著低于健康對照組,P<0.05。HIV組與AIDS組外周血B細胞百分數(shù)分別為(7.1±2.7)%與(8.6±3.4)%,與健康對照
14、組(9.2±5.5)%相比無差異。 2、中國HIV/AIDS患者外周血B細胞與CD4+T細胞、CD8+T細胞的相關(guān)性 HIV/AIDS患者外周血B細胞數(shù)量與CD4+T細胞數(shù)量顯著正相關(guān)(r=0.534,P=0.006);與CD8+T細胞數(shù)量不相關(guān)(r=0.301,P=0.107)。 3、CD19+B細胞分選純度 應(yīng)用MACS磁珠分選系統(tǒng)分選CD19+B細胞,分選所得細胞用流式細胞儀測定純度,CD19+B
15、細胞純度大于90%。 4、HIV/AIDS患者外周血B細胞TLR7與TLR9 mRNA表達與健康對照組的比較 HIV/AIDS患者外周血B細胞TIR9 mRNA的表達明顯低于健康對照組(P=0.023)。HIV組TLR9 mRNA的表達與健康對照組相比無顯著差異,P=0.05;AIDS組TLR9 mRNA的表達明顯低于健康對照組(P=0.042)。各組間TLR7 mRNA的表達無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 5
16、、HIV/AIDS患者外周血B細胞TLR7與TLR9 mRNA表達與健康對照組CD4+T細胞的相關(guān)性 HIV/AIDS患者外周血B細胞TLR9 mRNA的表達水平與CD4+T細胞數(shù)量正相關(guān)(r=0.390,P=0.040)。HIV/AIDS患者外周血B細胞TLR7 mRNA的表達水平與CD4+T細胞數(shù)量不相關(guān)。 結(jié)論: 1、HIV/AIDS患者外周血B細胞數(shù)量減少,而且B細胞數(shù)量與CD4+T細胞數(shù)量顯著正相關(guān),
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