hTERT啟動子核心序列的克隆及其在端粒酶陽性肺癌細胞中的靶向轉錄活性研究.pdf

1、目的：克隆人端粒酶催化亞單位(hTERT)啟動子核心序列片段，并構建hTERT啟動子調控的綠色熒光蛋白(GFP)基因表達質粒，初步研究hTERT啟動子在肺癌細胞A549和正常人胚肺成纖維細胞MRC-5中的轉錄活性，以便為肺癌靶向性基因治療的研究奠定基礎。 方法： 1．以人胚腎293細胞(HEK293)基因組DNA為模板，應用聚合酶鏈反應(PCR)方法，克隆具有轉錄活性的hTERT啟動子核心片段(238bp)，片段兩端含限

2、制性內切酶SalⅠ、BglⅡ的酶切位點。 2．將克隆的hTERT啟動子核心序列片段插入無啟動子的含綠色熒光蛋白(GFP)基因的報告質粒載體peGFP-1的多克隆位點中，構建含hTETR啟動子調控的綠色熒光蛋白表達質粒peGFP-1-hTERT，并對其進行序列測定。 3．用含有巨細胞病毒(CMV)啟動子的EGFP質粒peGFP-N1作為陽性對照，peGFP-1作為陰性對照，脂質體轉染法分別轉染肺癌細胞A549和端粒酶陰性的

3、人胚肺成纖維細胞株MRC-5，熒光顯微鏡下觀察兩種細胞綠色熒光蛋白(GFP)表達情況，初步確定hTERT啟動子在上述肺癌細胞株和MRC-5細胞株中的轉錄活性。 結果： 1．PCR產物電泳鑒定，顯示克隆的DNA片段長約230-250bp，DNA測序結果與GeneBank中hTERT啟動子的堿基序列完全一致，長為238bp。 2．限制性內切酶SalⅠ、BglⅡ雙酶切重組質粒peGFP-1-hTERT，分別得到4.2k

4、b、238bp的片段，與peGFP-1和hTERT啟動子核心片段(238bp)的大小相吻合；以peGFP-1-hTERT。為模板，PCR擴增出238bp大小DNA片段。 3．轉染陽性對照peGFP-N1質粒的肺癌細胞A549和端粒酶陰性的人胚肺成纖維細胞MRC-5均有綠色熒光蛋白(GFP)表達；轉染peGFP-1-hTERT的肺癌細胞A549有GFP表達，而轉染peGFP-1-hTERT的MRC-5無GFP表達；轉染陰性對照pe

5、GFP-1的肺癌細胞和MRC-5細胞均無GFP表達。 結論： 1．本課題成功克隆了長度為238bp的hTERT啟動子核心片段，并成功構建含hTETR啟動子調控的綠色熒光蛋白(GFP)基因表達質粒peGFP-1-hTERT； 2．hTERT啟動子在端粒酶陽性的肺癌細胞A549中有特異性的轉錄活性，而在人胚肺成纖維細胞MRC-5細胞中無轉錄活性： 3．hTETR啟動子能調控GFP在肺癌細胞中靶向性表達；CMV