NADPH氧化酶在血管緊張素Ⅱ誘導的大鼠腹膜纖維化中的作用研究.pdf

1、腹膜透析是終末期腎功能衰竭患者的主要腎臟替代療法。腹膜纖維化是長期腹膜透析患者的主要并發(fā)癥，最終會導致超濾功能的喪失以致退出腹膜透析。腹膜透析液的生物不相容性被認為是導致超濾失敗和腹膜纖維化的主要原因。然而，目前為止，腹膜纖維化發(fā)生的具體機制仍不十分清楚，而且防治的措施也較為有限，因此探討腹膜纖維化的發(fā)病機制，并尋求更為有效的治療方法，將具有重要的臨床意義。 血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)是RAS的重要組成成

2、分。目前認為，局部產(chǎn)生的Ang Ⅱ作為一種重要的生長因子調(diào)節(jié)細胞的增殖，凋亡以及纖維化進程。血管緊張素Ⅱ可以引起細胞外基質(zhì)的積聚以及細胞的轉(zhuǎn)分化。同時，AngⅡ促進多種炎癥因子的分泌，參與了AngⅡ引起的靶器官損傷過程。越來越多的證據(jù)表明，血管緊張素Ⅱ與腹膜纖維化的發(fā)生發(fā)展也密切相關(guān)，但其具體機制尚不十分明確。 近年來，活性氧(ROS)作為信號傳遞分子，在腹膜透析領域的作用正受到越來越多的關(guān)注。高糖腹膜透析液引起的氧化應激已被認

3、為是導致腹膜結(jié)構(gòu)和功能改變的主要因素之一。同時，血管緊張素Ⅱ也是引起氧化應激的最強刺激之一。因此我們推測，ROS可能參與了血管緊張素Ⅱ誘導的腹膜結(jié)構(gòu)及功能的改變。NADPH氧化酶是ROS的主要調(diào)控酶，其胞漿成分p47phox，p67phox和胞膜成分p22phox，gp91phox是NADPH氧化酶發(fā)揮活性的關(guān)鍵亞基。關(guān)于此酶及其各個亞基的結(jié)構(gòu)和功能目前國內(nèi)外已有相當多的研究，但大都集中在心血管系統(tǒng)，而腹膜間皮細胞中該酶的具體功能國內(nèi)外

4、報道則很少，鑒于此，我們著眼于NADPH氧化酶在腹膜纖維化進展中的作用進行研究，從而為腹膜纖維化的防治開辟一條新途徑。本研究應用Ang ⅡⅠ型受體(AT1)拮抗劑洛沙坦(Losartan)和NADPH氧化酶抑制劑DPI來觀察對Ang Ⅱ誘導的大鼠腹膜間皮細胞(RPMCs)ROS產(chǎn)生以及NADPH氧化酶表達的影響，并進一步觀察對下游效應包括炎癥因子的表達，RPMCs轉(zhuǎn)分化以及細胞外基質(zhì)積聚三方面的作用，以探討NADPH氧化酶依賴的ROS是

5、否介導了Ang Ⅱ誘導的腹膜纖維化的發(fā)生發(fā)展及其可能機制。 一、研究目的 探討NADPH氧化酶在Ang Ⅱ誘導的大鼠腹膜纖維化中的作用。 二、研究內(nèi)容 1．觀察大鼠腹膜間皮細胞中Ang Ⅱ誘導ROS產(chǎn)生和NADPH氧化酶的表達情況，以及Ang Ⅱ?qū)ρ装Y因子產(chǎn)生、轉(zhuǎn)分化和細胞外基質(zhì)積聚的影響。 2．探討NADPH氧化酶在Ang Ⅱ誘導的大鼠腹膜纖維化中的作用。 3．探討AT1受體是否介導了A

6、ngⅡ誘導的大鼠腹膜纖維化。 三、材料和方法1．細胞培養(yǎng)及分組采用胰酶消化法分離SD雄性大鼠原代腹膜間皮細胞，體外培養(yǎng)至第二代，并常規(guī)鑒定。將細胞靜止24小時使其同步化后，加入AngⅡ(10<'-7>M)孵育，部分實驗組中應用AngⅡⅠ型受體拮抗劑Losartan(10<'-5>M)或NADPH氧化酶活性抑制劑DPI(10<'-5>M)提前孵育1小時進行干預處理。 2．檢測方法 應用熒光染料(DCF)及激光共聚焦

7、顯微鏡檢測細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。RT-PCR檢測NADPH氧化酶亞單位p47phox，p67phox，p22phox，gp91phox以及PAI-l、α-SMA、E-cadherin、MCP-1、IL-6 mRNA的表達。Western blot檢測p47phox、α-SMA、PAI-1、COL-1的蛋白表達。 3．結(jié)果分析及統(tǒng)計學處理計算機密度分析采用單位面積計算機圖像掃描值減去背景值的均值表示信號強度，以GAPDH作為內(nèi)參照，計算兩者

8、吸光度的比值，并以對照組作為基準，計算其它各實驗組相對吸光度值，以x±s表示。兩組間比較采用獨立樣本凇驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 四、結(jié)果 1．RPMCs的培養(yǎng)和鑒定培養(yǎng)的RPMCs呈多邊形，菱形，橢圓形，大小不等。細胞融合后，呈典型的鵝卵石狀或鋪路石樣上皮細胞形態(tài)。免疫組化結(jié)果示細胞角蛋白陽性。 2．AngⅡ?qū)OS產(chǎn)生及NADPH氧化酶各亞單位表達的影響以及DPI和Losartan的干預作用2.1

9、AngⅡI對ROS產(chǎn)生及NADPH氧化酶各亞單位表達的影響Ang Ⅱ刺激RPMCs后可顯著增加細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，15 min時是對照組的3.64±0.53倍(P<0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示，Ang Ⅱ可誘導NADPH氧化酶亞單位p47phox，p22phox，gp91phox mRNA的表達上升，p67phox的表達雖有上升趨勢，但與0 h相比差異無統(tǒng)計學意義。Western blot結(jié)果顯示，AngⅡ可誘導p47phox蛋白表

10、達上調(diào)，以48 h為高峰(P<0.05)。 2.2 DPI和Losartan對Ang Ⅱ誘導的ROS產(chǎn)生及NADPH氧化酶各亞單位表達的干預作用Ang Ⅱ刺激RPMCs 15 min后可顯著增加細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，DPI和Losartan預處理可明顯減少由AngⅡ誘導的ROS的產(chǎn)生增加，與AngⅡ組相比，使ROS分別下降了86.8﹪和77.4﹪(P<0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示，Losartan和DPI預處理可阻斷由Ang

11、Ⅱ誘導的p47phox和gp91phox mRNA表達的上調(diào)。但是DPI卻顯著刺激了p67phox的上調(diào)，其機制有待進一步研究。 3．Ang Ⅱ?qū)ρ装Y因子產(chǎn)生的影響以及DPI和Losartan的干預作用AngⅡ刺激RPMCs 8小時后可誘導MCP-1 mRNA的表達上調(diào)，Losartan和DPI預處理可阻斷這種上調(diào)，使其分別降低了13.7﹪和53.6﹪(P<0.05)。AngⅡ顯著增加了IL-6 mRNA的表達，是正常對照組的1

12、.50±0.19倍，Losartan可抑制其表達上調(diào)，使其下降了33.4﹪(P<0.05)，但DPI卻明顯刺激了IL-6的表達上調(diào)，其機制有待進一步探討。 4．Ang Ⅱ誘導RPMCs轉(zhuǎn)分化以及DPI和Losartan的干預作用4.1 AngⅡ誘導RPMCs轉(zhuǎn)分化AngⅡ誘導腹膜間皮細胞轉(zhuǎn)分化標志α-SMA表達上調(diào)，其mRNA水平從2 h開始增加，4 h達高峰，為0 h組的1.84+0.19倍(P<0.05)，增高持續(xù)至12 h

13、。Westernblot結(jié)果也顯示，AngⅡ可明顯增加α-SMA蛋白水平的表達，隨時間逐漸增加，72 h達最高。AngⅡ可誘導E-Cadherin mRNA的表達下調(diào)，以12 h和24 h為著，24 h下降至0 h的59.3﹪(P<0.05)。 4.2 DPI和Losartan對AngⅡ誘導的RPMCs轉(zhuǎn)分化的影響Losartan預處理后可以阻斷由AngⅡ誘導的α-SMA表達上調(diào)，使α-SMAmRNA和蛋白水平降低，相比AngⅡ

14、組分別下降了25.4﹪和50.0﹪(P<0.05)。DPI也可以阻斷由AngⅡ誘導的α-SMA表達上調(diào)，與AngⅡ組相比，分別降低了其mRNA和蛋白水平的45.4﹪和56.1﹪(P<0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示，AngⅡ可誘導E-Cadherin mRNA的表達下調(diào)，Losartan和DPI可以明顯逆轉(zhuǎn)這種表達的下調(diào)，使其表達比AngⅡ組上升了63.8﹪和49.1﹪，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 5．Ang Ⅱ?qū)毎?/p>

15、基質(zhì)積聚的影響以及DPI和Losartan的干預作用5.1 Ang Ⅱ?qū)毎饣|(zhì)積聚的影響RT-PCR結(jié)果顯示，AngⅡ以時間依賴方式誘導PAI-1的mRNA表達上調(diào)，從2 h開始，持續(xù)至24 h，以8 h為高峰，為0 h組的3.50±0.56倍(P<0.05)。Western blot結(jié)果也顯示，AngⅡ刺激RPMCs 24小時后可上調(diào)PAI-1及COL-1的蛋白表達水平，分別為對照組的1.64±0.25和1.28±0.09倍(P<

16、0.05)。 5.2 DPI和Losartan對Ang Ⅱ誘導的細胞外基質(zhì)積聚的干預作用AngⅡ誘導RPMCs PAI-1的mRNA和蛋白表達上調(diào)，Losartan和DPI可顯著降低PAI-1的表達水平(P<0.05)。AngⅡ刺激RPMCs 24小時后可上調(diào)COL-1的蛋白表達水平，與刺激組相比，DPI可明顯阻斷這種上調(diào)，使其降低了71.9﹪(P<0.05)，而Losartan預處理則沒有統(tǒng)計學差異。 五、結(jié)論