青蒿琥酯誘導K562細胞凋亡過程中鐵轉(zhuǎn)運蛋白變化的研究.pdf

1、研究背景與目的： 綜上所述，大多數(shù)腫瘤細胞表面TfR1表達增多，使通過TfR1途徑內(nèi)流的鐵多于正常細胞，提示鐵可能成為腫瘤治療的新靶點。與鐵內(nèi)流和外流相關(guān)的蛋白DMT1、FPN1在腫瘤細胞中的表達是如何變化的，經(jīng)PubMed檢索，目前僅有的四篇文獻報道的都是實體瘤。沒有有關(guān)白血病方面的報道。雖然青蒿素在體內(nèi)體外的抗癌作用已被廣泛報道，實驗表明鐵與青蒿琥酯在誘導腫瘤細胞凋亡時也有協(xié)同作用，但是作用的分子機理尚不清楚，青蒿素及其衍生

2、物與鐵的作用位點尚需進一步研究，青蒿素是否影響腫瘤細胞與鐵內(nèi)流和外流相關(guān)的蛋白TfRl、DMT1、FPN1也未見報道。青蒿素作用于耐藥細胞能否通過影響TfR1、DMT1、FPN1的表達而逆轉(zhuǎn)耐藥也未見報道。 本課題擬研究： ①CML-CP和CML-BC患者骨髓單個核細胞的TfR1、DMT1、FPN1在mRNA水平和TfR1(CD71)在蛋白水平的表達以及血清鐵蛋白的變化。 ②以K562細胞作為體外研究CML的細胞

3、模型，探討青蒿琥酯誘導K562細胞凋亡時TfR1、DMT1、FPN1在mRNA和TfR1(CD71)、DMT1在蛋白水平的表達變化。并以DFO為對照，研究二者對鐵轉(zhuǎn)運蛋白影響的異同。 ③以耐伊馬替尼的K562細胞(K562resistance，K562-R)作為體外研究CML耐藥的細胞模型，探討青蒿琥酯能否誘導K562-R細胞凋亡，并進一步探討對K562-R細胞的TfR1、DMT1、FPN1在mRNA和TfR1(CD71)、DM

4、T1在蛋白水平的表達變化。為尋找新的治療CML的靶向藥物提供理論依據(jù)。 研究方法： 1.2006～2007年在南方醫(yī)院血液科門診或住院治療的CML患者共13例，其中CML-CP8例，CML-BC5例。3例非惡性腫瘤患者作為正常對照。用放射免疫法測定血清鐵蛋白值，用半定量RT-PCR的方法分析患者和對照骨髓標本單個核細胞中TfR1mRNA、DMT1mRNA和FPN1mRNA的表達，并用流式細胞儀測TfR1(CD71)在蛋白

5、水平的表達。 2.用MTT法檢測青蒿琥酯抑制K562細胞增殖作用。設青蒿琥酯終濃度分別為：4×10-5mol/L、2×10-4mol/L、10-3mol/L三個組，并設24h、48h和72h三個時間組進行實驗。并用此三個濃度以48h和72h二個時間段用hnnexinV-PI雙染和Hochest33258染色檢測凋亡。以K562細胞未處理組為空白對照，用半定量RT-PCR方法檢測上述三個濃度的青蒿琥酯和20μM去鐵敏處理K562細

6、胞48h后TfR1、DMT1和FPN1mRNA表達的變化：用流式細胞儀檢測三個濃度的青蒿琥酯和20μM去鐵敏處理K562細胞48h后TfR1蛋白(CD71)表達的變化，并用westernblot法檢測2×10-4mol/L青蒿琥酯處理K562細胞48h后DMT1蛋白的表達。 3.用MTT法檢測青蒿琥酯抑制K562-R細胞增殖作用。設青蒿琥酯終濃度分別為4×10-5mol/L、2×10-4mol/L、10-3mol/L三個組，設作

7、用時間48h進行增殖實驗，AnnexinV-PI雙染后以流式細胞術(shù)檢測凋亡。以K562-R細胞未處理組為空白對照，用半定量RT-PCR方法檢測三個濃度的青蒿琥酯處理K562-R細胞48h后TfR1、DMT1和FPN1mRNA表達的變化；用流式細胞儀檢NTfR1蛋白(CD71)表達的變化，并用westernblot法檢測2×10-4mol/L青蒿琥酯處理K562-R細胞48h后DMT1蛋白的表達。 4.統(tǒng)計方法：采用SPSS11.

8、5統(tǒng)計軟件，以AONEWAYANOVA，非參數(shù)秩和檢驗和單樣本t檢驗，P<0.05為有顯著性差異的標準。 研究結(jié)果： 1.CML-CP和BC期的血清鐵蛋白值都高于對照組，但僅CML-BC與對照組有顯著性差異(P=0.020)。CML-CP和BC期TfR1mRNA、DMT1mRNA和FPN1mRNA都比對照組高，且與對照組比較有顯著性差異(TfR1mRNA：P=0.000，P=0.000；+IRE-DMT1mRNA：P=0

9、.000，P=0.000；FPN1mRNAP=0.029，P=0.003)。CML-CP和BC期之間無顯著性差異(P>0.05)。CML-CP和BC期CDT1都比對照組高，CML-BC期與對照組比較有顯著性差異(P=0.034)，CML-CP與對照組以及CML-CP和BC期之間無顯著性差異(P>0.05)。 2.4×10-5mol/L、2×10-4mol/L與10-3mol/L青蒿琥酯處理K562細胞24h、48h和72h時，各

10、濃度組的細胞抑制率與對照組比較，都有顯著性差異(P<0.05)。組間比較顯示：24h組2×10-4mol/L與10-3mol/L的細胞抑制率比較，P=0.005：48h組相鄰濃度的組間細胞抑制率有顯著性差異(P<0.05)。72h組相鄰濃度組間比較顯示：僅2×10-4mol/L與10-3mol/L的細胞抑制率之間有顯著性差異(P=0.001)。AnnexinV-PI雙染檢測顯示：4×10-5mol/L、2×10-4mol/L、10-3m

11、ol/L青蒿琥酯處理K562細胞48h，72h，細胞總凋亡率呈時間和濃度依賴性。多重組間比較顯示：48h和72h組中，三個濃度的組間凋亡率有顯著性差異(P<0.01)。用半定量RT-PCR方法檢測低、中、高濃度的青蒿琥酯和20μM去鐵敏處理K562細胞48h后，青蒿琥酯使K562細胞表面的TfR1mRNA表達比對照組減少(P=0.014，0.000，0.000)，且呈濃度依賴性。去鐵敏使K562細胞表面的TfR1mRNA表達比對照組增加

12、(P=0.015)。低濃度青蒿琥酯使K562細胞+IRE-DMT1mRNA表達降低，中高濃度使其不表達。 3.4×10-5mol/L、2×10-4mol/L與10-3mol/L青蒿琥酯處理K562-R細胞48h時，各濃度組的細胞抑制率與對照組比較，都有顯著性差異(P=0.000)。組間比較顯示：相鄰濃度的組間細胞抑制率有顯著性差異(P值依次是：P=0.011，P=0.013)。AnnexinV-PI雙染檢測顯示：4×10-5mo

13、l/L、2×10-4mol/L、10-3mol/L青蒿琥酯處理K562-R細胞48h，細胞總凋亡率呈時間和濃度依賴性。多重組間比較顯示：相鄰濃度的組間凋亡率有顯著性差異(P值依次為0.000，0.003)。用半定量RT-PCR方法檢測低、中、高濃度的青蒿琥酯處理K562-R細胞48h后，青蒿琥酯使K562-R細胞表面的TfR1mRNA表達比對照組減少(0.001，0.000，0.000)，且呈濃度依賴性。低濃度青蒿琥酯使K562-R細胞

14、+IRE-DMT1mRNA表達降低，中、高濃度使其不表達。青蒿琥酯處理組FPN1mRNA表達較對照組減少(P都是0.000)，且呈濃度依賴性。用流式細胞儀檢測顯示：青蒿琥酯處理組的CD71陽性率較對照組低，且呈濃度依賴性(P=0.006，0.000，0.000)。用兔抗人的+IRE-DMT1多克隆抗體用westernblot方法研究表明：中濃度青蒿琥酯使+IRE-DMT1蛋白不表達。 初步結(jié)論： 1.CML細胞可能通過高

15、表達TfR1攝取比正常細胞更多的鐵，促進DMT1的高表達使之能轉(zhuǎn)運更多的Fe2+進入細胞漿，參與細胞增殖、代謝；通過高表達FPN1mRNA使鐵外流也增多；CML患者血清鐵蛋白值高于正常對照。由于CML原代細胞可以合成和分泌鐵蛋白。因此是否提示細胞鐵內(nèi)流多于外流尚需進一步研究。此項研究目前尚未見國內(nèi)外文獻報道。 2.青蒿琥酯除了通過與腫瘤細胞內(nèi)的Fe2+結(jié)合形成自由基殺死細胞外，還可能通過減低TfR1在mRNA和蛋白水平的表達使K

16、562細胞經(jīng)TfR1-Tf途徑攝取鐵減少，通過降低DMT1在mRNA和蛋白水平的表達，使細胞從內(nèi)吞體轉(zhuǎn)運到細胞漿的Fe2+減少，線粒體可利用鐵也減少，通過減少FPN1mRNA的表達，使細胞鐵外流減少，從而抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡。去鐵敏可能通過增加K562細胞表面的TfR1在mRNA和蛋白水平的表達，使K562細胞經(jīng)TfR1-Tf途徑攝取鐵增多，通過降低DMT1在mRNA和蛋白水平的表達，使細胞從內(nèi)吞體轉(zhuǎn)運到細胞漿的Fe2+減少，線粒

17、體可利用鐵也減少，通過減少FPN1mRNA的表達使鐵外流減少，從而抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡。此項研究尚未見國內(nèi)外文獻報道。 3.青蒿琥酯可能通過下調(diào)TfR1在mRNA和蛋白水平的表達使K562-R細胞經(jīng)TfR1-Tf途徑攝取鐵減少，通過降低DMT1在mRNA和蛋白水平的表達，使細胞從內(nèi)吞體轉(zhuǎn)運到細胞漿的Fe2+減少，線粒體可利用鐵也減少，通過減少FPN1mRNA的表達，使細胞鐵外流減少，從而逆轉(zhuǎn)耐藥。此項研究尚未見國內(nèi)外文獻報