流行性乙型腦炎病毒E蛋白及其結(jié)構(gòu)域Ⅲ的原核表達及酵母雙雜交系統(tǒng)的初步構(gòu)建.pdf

1、流行性乙型腦炎簡稱乙腦，是由乙腦病毒（也稱日本腦炎病毒，Japaneseencephalitis virus，JEV）引起、由蚊蟲傳播的一種急性病毒性傳染病，主要侵害中樞神經(jīng)系統(tǒng)，對人類健康威脅很大。WHO估計，目前乙腦每年發(fā)病約50000例，其中約1/3的病例死亡，且乙腦后遺癥嚴重，存活者20％~40％留有神經(jīng)麻痹和心理改變等嚴重后遺癥，給家庭和社會造成了巨大的經(jīng)濟和精神負擔。近幾年我國乙腦報告病例數(shù)每年在5000～10000例之間，

2、病死率約5％-35％，且有15％的幸存者可發(fā)生嚴重的神經(jīng)精神后遺癥。盡管目前對JEV的分子生物學、免疫學特性的研究和乙腦的臨床救治等取得了很大的進展，疫苗的應用也使乙腦的發(fā)病率有所下降，但是關(guān)于JEV感染的分子機制還不完全清楚。 病毒受體決定了病毒的宿主范圍、組織及細胞親嗜性，并影響其致病性。 一般認為JEV囊膜糖蛋白E是該病毒的受體結(jié)合蛋白（VAP），能夠介導病毒與細胞的膜融合。研究發(fā)現(xiàn)E蛋白抗原決定簇分為三個區(qū)，即結(jié)

3、構(gòu)域Ⅰ、結(jié)構(gòu)域Ⅱ和結(jié)構(gòu)域Ⅲ。其中結(jié)構(gòu)域Ⅱ被認為具有中和與血凝活性的表位，而結(jié)構(gòu)域Ⅲ是受體的主要結(jié)合部位，能夠介導病毒與細胞的膜融合。 本研究利用大腸埃希菌表達了JEV的E蛋白和E蛋白的結(jié)構(gòu)域Ⅲ，還構(gòu)建了以JEV的E蛋白為誘餌蛋白的酵母雙雜交系統(tǒng)，為進一步研究JEV E蛋白的結(jié)構(gòu)與功能特別是與其受體蛋白的相互作用提供了物質(zhì)基礎。 1．JEV E 蛋白的原核表達及其鑒定 從JEV感染乳鼠腦中提取總RNA，采用特異性引

4、物擴增出JEV E蛋白基因。將E基因克隆到pMD18-T載體中，經(jīng)酶切鑒定和序列測定無誤后，再將該基因克隆到表達載體pET28a中，并轉(zhuǎn)化E. Coli后進行誘導表達。SDS-PAGE鑒定結(jié)果表明，在相對分子質(zhì)量約53kDa處有明顯的條帶，與預期的6His-E融和蛋白大小一致；表達蛋白主要以包涵體形體存在于沉淀中。薄層掃描顯示目的蛋白占菌體總蛋白的40％。采用Ni2+-NTA親和色譜柱進行純化，獲得了純化的JEV E蛋白。Western

5、 blot分析結(jié)果表明，表達的JEV E蛋白較好地保持了與抗JEV mAb和多抗的結(jié)合活性。 2．JEV E 蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ的原核表達及其鑒定 從JEV感染乳鼠腦中提取總RNA，采用特異性引物擴增出JEV E蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ的基因。將結(jié)構(gòu)域Ⅲ的基因克隆到pMD18-T載體中，經(jīng)酶切鑒定和序列測定無誤后，再將該基因克隆到表達載體pET32a中，并轉(zhuǎn)化E. Coli后進行誘導表達。SDS-PAGE鑒定結(jié)果表明，在相對分子質(zhì)量約20

6、kDa處有明顯的條帶，與預期的6His-E-Ⅲ融和蛋白大小一致；表達蛋白約50％以包涵體形體存在于沉淀中，50％以可溶性形式存在于上清中。薄層掃描顯示目的蛋白占菌體總蛋白的40％。采用Ni2+-NTA親和色譜柱進行純化，獲得了純化的JEV E蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ蛋白。采用抗his mAb進行Western blot分析，結(jié)果表明，表達的該融合蛋白較好地保持了與抗體的結(jié)合活性。3．JEV E 蛋白在酵母雙雜交系統(tǒng)中的表達及其對報告基因激活作用的檢

7、測將JEV E 蛋白基因片段克隆入載體pUC19 中，經(jīng)酶切鑒定和序列測定無誤后，再將該基因克隆到表達載體pGBKT7 中，并轉(zhuǎn)化入酵母菌AH109，獲得了以JEV E 為誘餌蛋白的酵母雙雜交系統(tǒng)。檢測該系統(tǒng)中JEV E 對酵母細胞有無毒性作用及對報告基因有無激活作用。 結(jié)果 帶有重組表達質(zhì)粒的AH109 酵母菌在His 營養(yǎng)缺陷的SD 培養(yǎng)基上不生長，表明構(gòu)建的JEV E蛋白對His3 基因無激活作用；β-半乳糖苷酶印