過(guò)表達(dá)肌漿網(wǎng)鈣ATP酶2a抑制缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡的研究.pdf

1、缺血性心臟病是目前心力衰竭發(fā)生的主要原因之一，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升的趨勢(shì)。隨著細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的飛速進(jìn)展，人們對(duì)缺血性心臟病發(fā)生、發(fā)展機(jī)制有了進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，其防治措施也取得了較大進(jìn)展?；蛑委熥鳛橐环N新的治療策略為缺血性心臟病的治療提供了新的途徑。近年來(lái)有關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與效應(yīng)的研究非常活躍。研究發(fā)現(xiàn)，ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在心肌缺血、心力衰竭進(jìn)展過(guò)程

2、中起重要作用。有研究表明，主動(dòng)脈縮窄引起的心臟壓力過(guò)負(fù)荷可以誘導(dǎo)ERS，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡增多，而轉(zhuǎn)基因高表達(dá)GRP78、GRP94等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶可減輕甚至取消內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、促進(jìn)細(xì)胞存活。
　　 鈣穩(wěn)態(tài)失衡是誘導(dǎo)ERS發(fā)生的重要原因。在參與Ca2+循環(huán)的各種Ca2+調(diào)節(jié)蛋白中，肌漿網(wǎng)鈣ATP酶2a(sarcoplasmic reticulum calcium ATPase2a，SERCA2a)的蛋白水平和活化程度是細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)

3、態(tài)的決定性因素。SERCA2a表達(dá)降低和活化程度下降是心力衰竭心肌舒縮功能異常的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。既往研究表明，轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)SERCA2a可以提高心臟的泵血功能，改善血流動(dòng)力學(xué)狀況。最近有研究證實(shí)，過(guò)表達(dá)SERCA2a還可以延緩心肌梗死后心力衰竭的發(fā)生，但具體機(jī)制尚未闡明?；谝酝芯考艾F(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，我們推測(cè)過(guò)表達(dá)SERCA2a可能有助于減輕心肌缺血缺氧造成的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，具有保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。本研究在離體細(xì)胞水平，觀察缺氧情況下心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

4、應(yīng)激的主要過(guò)程。以重組病毒rAd-SERCA2a為載體，觀察過(guò)表達(dá)SERCA2a對(duì)缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及相關(guān)凋亡途徑的影響。旨在為過(guò)表達(dá)SERCA2a的基因治療方法應(yīng)用于缺血性心力衰竭提供理論基礎(chǔ)。
　　 首先，本研究利用人胚胎腎細(xì)胞(HEK293細(xì)胞)擴(kuò)增重組腺病毒rAd-SERCA2a及rAd-GFP，并通過(guò)Touchdown-PCR鑒定，證實(shí)重組入腺病毒基因的正確性。利用攜帶報(bào)告基因的重組腺病毒rAd-GFP轉(zhuǎn)染心肌

5、細(xì)胞，以及利用乳酸脫氫酶(LDH)觀察轉(zhuǎn)染對(duì)心肌細(xì)胞損傷程度，確定最佳的MOI值。為開(kāi)展基因靶向性轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞打下基礎(chǔ)。
　　 其次，將體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞進(jìn)行缺氧處理，觀察不同時(shí)間內(nèi)心肌細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的情況。采用Western blot方法檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志性蛋白GRP78、CHOP、Caspase-12表達(dá)變化，DNA ladder及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞缺氧6h后GRP78蛋白表達(dá)水平逐漸升高

6、，至缺氧24h達(dá)峰值，隨后表達(dá)有所下降。說(shuō)明缺氧能夠誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78表達(dá)升高，但其表達(dá)水平具有一定的時(shí)效性。即缺氧早期(24h內(nèi))，GRP78蛋白表達(dá)豐度逐漸增加，其對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用也逐漸增強(qiáng)，而持續(xù)長(zhǎng)時(shí)間缺氧(24h以上)，GRP78表達(dá)相對(duì)下降，對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用減弱。缺氧12h后凋亡因子CHOP和Caspase-12蛋白表達(dá)逐漸增加，36h后表達(dá)水平顯著升高。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，心肌細(xì)胞凋亡率逐漸上升

7、。提示缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并且隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)機(jī)制轉(zhuǎn)向細(xì)胞損傷機(jī)制，心肌細(xì)胞最終發(fā)生凋亡。
　　 隨后，以重組腺病毒載體過(guò)表達(dá)SERCA2a后，再給予缺氧或衣霉素刺激，觀察過(guò)表達(dá)SERCA2a對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，與缺氧組比較，SERCA2a+缺氧組GRP78表達(dá)無(wú)明顯變化，但是CHOP蛋白表達(dá)水平明顯下降，而Caspase-3蛋白表達(dá)也較缺氧組降低39.7％。SERCA2

8、a+缺氧組的細(xì)胞凋亡率較缺氧組明顯降低(P<0.05).提示過(guò)表達(dá)SERCA2a蛋白可減輕缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的強(qiáng)度，對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷具有重要的防護(hù)作用。其作用機(jī)制：過(guò)表達(dá)SERCA2a雖然不能提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子伴侶GRP78等保護(hù)性蛋白的表達(dá)水平，但是可以抑制凋亡因子CHOP、Caspase-3等表達(dá)，進(jìn)而減輕心肌細(xì)胞凋亡。
　　 最后，利用Fura-3和激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+的變化。結(jié)果顯