麗江大黃中四種成分對(duì)小鼠顱頂前成骨細(xì)胞MC3T3-E1增殖分化的影響.pdf

1、最近研究發(fā)現(xiàn)大黃具有抗骨質(zhì)疏松的作用，麗江大黃作為中藥大黃的一種，其含有很多活性成分。成骨細(xì)胞在骨質(zhì)疏松中起著至關(guān)重要的作用，MC3T3-El細(xì)胞系是一個(gè)能夠代表成骨細(xì)胞分化的經(jīng)典模型，常用來(lái)做體外藥物篩選研究。本論文通過(guò)實(shí)驗(yàn)探討麗江大黃中的幾種成分對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞分化過(guò)程中的影響及可能機(jī)制，從而為其在骨質(zhì)疏松方面的研究提供理論基礎(chǔ)與依據(jù)。本研究分為兩個(gè)部分：第一部分建立小鼠顱頂前成骨細(xì)胞MC3T3-E1分化模型，對(duì)每一階段特異性

2、指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)以確定MC3T3-E1細(xì)胞誘導(dǎo)成功；第二部分研究中藥麗江大黃中4種活性物質(zhì)脫氧土大黃苷、大黃素、蘆薈大黃素和RDET(含有幾種單體的混合物)對(duì)小鼠顱頂前成骨細(xì)胞MC3T3-E1增殖與分化的影響。
　　選取2種誘導(dǎo)液：誘導(dǎo)液Ⅰ(抗壞血酸50μg/ml、β-甘油磷酸鈉10mmol/l)與誘導(dǎo)液Ⅱ(抗壞血酸50μg/ml、β-甘油磷酸鈉10mmol/l、地塞米松10-8 mol/l)；采用堿性磷酸酶（ALP）染色法、茜素紅染

3、色法選取最佳誘導(dǎo)液Ⅱ，再通過(guò)免疫組化法檢測(cè)骨鈣素含量、馮庫(kù)薩染色檢測(cè)鈣結(jié)節(jié)等確定誘導(dǎo)建立模型成功；小鼠顱頂前成骨細(xì)胞MC3T3-E1，在誘導(dǎo)液Ⅱ誘導(dǎo)分化的作用下，分化為成骨細(xì)胞，采用噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)幾種活性成分對(duì)分化后的MC3T3-E1細(xì)胞增殖作用；檢測(cè)堿性磷酸酶(ALP)的表達(dá)以及其活性；茜素紅染色法和馮庫(kù)薩染色法檢測(cè)鈣化結(jié)節(jié)；免疫組化法檢測(cè)骨鈣素含量；采用RT-PCR檢測(cè)活性成分對(duì)OPG/RNNKL表達(dá)的影響。
　　通過(guò)

4、染色結(jié)果確定誘導(dǎo)液Ⅱ與誘導(dǎo)液Ⅰ均能將MC3T3-E1誘導(dǎo)成成骨細(xì)胞，但誘導(dǎo)液Ⅱ的效果更佳，因此選取誘導(dǎo)液Ⅱ?yàn)檎T導(dǎo)液。MTT結(jié)果顯示脫氧土大黃苷在10μg/ml以上對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞有促進(jìn)增殖的影響。RDET與大黃素在40μg/ml以上對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞有促進(jìn)增殖的作用、蘆薈大黃素沒(méi)有明顯的促進(jìn)增殖影響。ALP染色結(jié)果顯示脫氧土大黃苷、蘆薈大黃素、RDET在10μg/ml作用濃度下提高ALP活性，大黃素沒(méi)有明顯的作用；而ALP酶活

5、性測(cè)定顯示RDET與模型組相差不大。脫氧土大黃苷與RDET可以促進(jìn)骨鈣素減少。茜素紅染色與馮庫(kù)薩染色結(jié)果為：蘆薈大黃素與大黃素作用的細(xì)胞所產(chǎn)生的礦結(jié)節(jié)較多，但大黃素作用的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生較大的改變。分化早期與中期活性成分對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞中OPG的增多沒(méi)有明顯的效果，晚期會(huì)發(fā)現(xiàn)RDET促進(jìn)了OPG數(shù)量的增加。
　　誘導(dǎo)液Ⅱ(抗壞血酸50μg/ml、β-甘油磷酸鈉10mml/l、地塞米松10-8 mol/l)能更好的誘導(dǎo)MC3T3-