雙胚苗水稻中單倍體與二倍體表型和基因表達(dá)的差異分析.pdf

1、SARⅡ-628是四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻所的一個(gè)雙胚苗自然群體，每年都能定期分離出單倍體與二倍體(n∶2n)、二倍體與三倍體(2n∶3n)的雙苗植株。其單倍體的異交結(jié)實(shí)率明顯高于普通的單倍體，其三倍體的雜交后代會(huì)出現(xiàn)早世代穩(wěn)定的現(xiàn)象。本研究對(duì)單倍體及其對(duì)應(yīng)二倍體的外觀形態(tài)、農(nóng)藝性狀及細(xì)胞學(xué)行為進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)單倍體在終變期的染色體主要構(gòu)型是12個(gè)Ⅰ，在后期Ⅰ染色體的分離方式也多種多樣，其中以6-6的方式居多。在DNA水平上進(jìn)行分子生物學(xué)研究，發(fā)

2、現(xiàn)它們?cè)诨蚪M上沒(méi)有差別，從而表明這些表型差異是由水稻的倍性造成的。本實(shí)驗(yàn)在DNA水平上和RNA水平上選用了甲基化分析、基因芯片技術(shù)、cDNA-AFLP和RT-PCR技術(shù)等來(lái)研究這些與倍性相關(guān)的基因表達(dá)的差異變化，具體結(jié)果如下： 一、本研究用改良AFLP方法(MSAP)分析了5個(gè)單倍體及其對(duì)應(yīng)二倍體總DNA5'-CCGG位點(diǎn)胞嘧啶的甲基化水平和單倍體與對(duì)應(yīng)二倍體的甲基化差異模式。研究發(fā)現(xiàn)單倍體的甲基化水平高于對(duì)應(yīng)的二倍體，是單倍

3、體相對(duì)于二倍體甲基化模式經(jīng)過(guò)重新調(diào)整，在其基因組中甲基化水平發(fā)生了總體變化以適應(yīng)生存的必然結(jié)果。具體結(jié)果如下： 1.發(fā)現(xiàn)5個(gè)二倍體在482個(gè)位點(diǎn)上甲基化狀態(tài)沒(méi)有差異，與二倍體比較，單倍體雖然在甲基化總體水平上變化不大，但共有43個(gè)位點(diǎn)甲基化類型在不同單株上發(fā)生了變異。 2.單倍體的甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性比率即擴(kuò)增的總甲基化位點(diǎn)數(shù)占總擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)的比率平均為18.77％，全甲基化(雙鏈CmCGG)率平均為10.48％，都高于二

4、倍體。表明二倍體突變成單倍體后，某些位點(diǎn)發(fā)生了超甲基化。 3.單倍體與其對(duì)應(yīng)二倍體比較，有5種類型的改變：①單倍體與二倍體甲基化模式相同；②去甲基化；⑧超甲基化；④次甲基化；⑤不定類型。 4.對(duì)18個(gè)位點(diǎn)測(cè)序檢索顯示：這些甲基化變異涉及整個(gè)水稻基因組的12條染色體且具有位點(diǎn)特異性，不同單株的變異位點(diǎn)各不相同。 二、基因芯片技術(shù)是新的分子生物學(xué)研究工具。本研究運(yùn)用cDNA基因芯片技術(shù)對(duì)來(lái)源于SARⅡ-628的單倍體

5、及其對(duì)應(yīng)二倍體水稻的葉片中RNA水平的表達(dá)變化情況進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)兩者之間序列的表達(dá)量變化范圍較廣，特只統(tǒng)計(jì)分析變化量在2倍及其以上的序列。結(jié)果如下： 1.單倍化后，發(fā)生表達(dá)變化的序列占水稻總探針序列的2.47％，其中激活變化的占0.34％，沉默變化的占0.27％，激活的序列數(shù)量多于沉默的。 2.序列的表達(dá)變化量之間也存在一定的差異，一般變化倍數(shù)在2-10之間，但是表達(dá)變化量主要集中在2-3倍之間，隨著表達(dá)量變化倍數(shù)的

6、增加，這些序列所占的比例也逐漸縮小。 3.單倍化后，發(fā)生表達(dá)變化的序列隨機(jī)分布在水稻的12條染色體上。發(fā)現(xiàn)有33個(gè)序列在染色體上的分布具有成簇分布的特點(diǎn)。 4.對(duì)單倍化中已經(jīng)預(yù)測(cè)功能的575條倍性敏感序列進(jìn)行功能分類，發(fā)現(xiàn)都涉及了生物過(guò)程、細(xì)胞成份和分子功能這3個(gè)方面，各自所占的比列為82.09％、90.96％和42.09％。有些序列具有多種功能，但具有1-2種功能的序列所占的比例最多。 5.將單倍體中功能分類結(jié)

7、果與9311的分類結(jié)果從3大類15個(gè)亞類進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)所有發(fā)生變化的序列在功能上的比例相近，說(shuō)明這些序列的表達(dá)變化并非是植株隨機(jī)發(fā)生的調(diào)整。 三、為驗(yàn)證芯片中發(fā)生表達(dá)變化的序列是否具有單株特異性或者器官特異性，需要通過(guò)RT-PCR方法在不同的單倍體單株和不同的器官中進(jìn)行分析。特選取芯片中3個(gè)激活序列和4個(gè)沉默序列在7個(gè)單倍體和1個(gè)對(duì)應(yīng)二倍體的根、莖、穗和葉共32個(gè)樣本中的cDNA中進(jìn)行RT-PCR的表達(dá)一致性驗(yàn)證。結(jié)果如下：

8、 1.對(duì)這32個(gè)樣本運(yùn)用水稻的內(nèi)參進(jìn)行模板的質(zhì)量驗(yàn)證，所有的根、穗和葉的樣本都正常出帶，但所有莖的cDNA都不能擴(kuò)增出帶，而選用不同的引物卻又能在莖中擴(kuò)增出帶。 2.7個(gè)序列在32個(gè)樣本中的擴(kuò)增顯示它們各自具有不同的表達(dá)優(yōu)勢(shì)，在葉片中的結(jié)果與芯片中的結(jié)果相似，在其它器官中的表達(dá)具有特異性。 3.7個(gè)序列在7個(gè)單倍體中的表達(dá)結(jié)果相似，與二倍體相比，它們?cè)谌~和根中具有一定的保守性，在莖和穗中則對(duì)倍性變化較為敏感。

9、 四、提取3個(gè)單倍體和1個(gè)二倍體的根、莖、穗和葉的cDNA，用EcoRⅠ和MspⅠ進(jìn)行酶切、連接、預(yù)擴(kuò)和選擴(kuò)等操作，通過(guò)cDNA-AFLP技術(shù)統(tǒng)計(jì)這16個(gè)樣本的表達(dá)差異。共選用30對(duì)引物，在633條擴(kuò)增位點(diǎn)上篩選出49個(gè)有差異表達(dá)的序列。具體結(jié)果如下： 1.單倍化后cDNA-AFLP總體水平雖然在各單株間略有差異但變化不大，表達(dá)變化的位點(diǎn)所占比例平均為5.14％，高于二倍體的3.93％。 2.根據(jù)樣本在根、莖、穗和葉中表

10、達(dá)出帶的有無(wú)，發(fā)現(xiàn)共擴(kuò)增出的14種帶型中，有4種帶型只出現(xiàn)在單倍體中，其對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的表達(dá)具有單倍體的特異性。 3.對(duì)這3個(gè)單倍體在不同器官的激活和沉默位點(diǎn)進(jìn)行匯總，發(fā)現(xiàn)在根和穗中，發(fā)生沉默的位點(diǎn)多于激活的位點(diǎn)數(shù)，而在莖和葉中的結(jié)果正好與之相反但是在單倍體的所有器官中發(fā)生激活變化的位點(diǎn)多于沉默變化的位點(diǎn)。 4.對(duì)不同器官中的發(fā)生表達(dá)變化(激活+沉默)位點(diǎn)分析，發(fā)現(xiàn)根中的變化位點(diǎn)最多，在穗中的變化最少，說(shuō)明位點(diǎn)的表達(dá)變化具有器