Survivin特異性小發(fā)夾RNA真核表達載體的構(gòu)建及其對HL-60細胞的影響.pdf

1、RNA干擾(RNA interference,RNAi)是由siRNA(small interfering RNA,siRNA)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默.作用機制包括起始階段和效應(yīng)階段,在起始階段,雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)在Dicer酶的作用下,被降解為21～23堿基的siRAN.在效應(yīng)階段,siRNA雙鏈結(jié)合一個核酶復(fù)合物從而形成RNA誘導(dǎo)活化沉默復(fù)合物(RNA-indtreed silencing

2、 complex,RISC),激活的RISC通過堿基配對定位到同源mRNA轉(zhuǎn)錄本上,從而導(dǎo)致mRNA降解,出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后的基因沉默.RNAi自1998年被發(fā)現(xiàn)以來,國內(nèi)外學者對其進行了大量的研究工作,證實了RNAi技術(shù)不僅基因抑制效果確切,而且有嚴格的序列特異性,治療針對性強,副作用小.到目前為止,該技術(shù)已在多種惡性腫瘤和白血病細胞的研究中應(yīng)用,均顯示出良好的基因沉默效果.因此,RNAi是目前基因治療的良好手段. Survivn基因

3、是凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptotic protein,IAP)成員之一,位于17q25染色體,基因長度為14.7kb,能編碼142個氨基酸組成的分子量約為16.5kD的胞質(zhì)蛋白.它的BIR結(jié)構(gòu)域可以通過抑制caspase-3和caspase-7而導(dǎo)致細胞凋亡.國內(nèi)外研究證實,survivin在正常成人組織中不表達,而在惡性腫瘤細胞及白血病細胞中高表達,并且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有關(guān).文獻報導(dǎo),應(yīng)用反義寡核苷

4、酸技術(shù)和RNAi技術(shù)沉默survivin基因可以導(dǎo)致其他惡性腫瘤細胞凋亡.因此,survivin可能成為白血病基因治療的一個新靶點. 白血病是血液系統(tǒng)的惡性腫瘤,發(fā)病率高,惡性度強,嚴重影響人們的生活質(zhì)量.20世紀80年代以來,白血病的治療取得了較大的進展,大劑量化療、造血干細胞移植及免疫治療的聯(lián)合應(yīng)用,大大提高了白血病患者的生存率.但大劑量化療具有嚴重的毒副作用,造血干細胞移植費用昂貴,且具有移植物抗宿主病等并發(fā)癥,限制了其臨

5、床廣泛應(yīng)用. 有研究顯示以RNA干擾沉默BCR/ABL基因可以促進CML細胞株K562細胞凋亡、抑制其增殖.但以RNA干擾沉默survivin基因?qū)Π籽』蛑委煹难芯繄髮?dǎo)較少,本研究通過構(gòu)建Survivin特異性小發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表達載體、利用Lipofectamine 2000<'TM>脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到HL-60細胞.研究survivin基因?qū)Π籽〖毎脑鲋?、蛋白表達及凋亡的影響

6、.旨在為以Survivin基因為靶點,RNA干擾為手段的白血病和其他惡性腫瘤的基因治療的研究提供技術(shù)手段和理論基礎(chǔ). 方法: (1)構(gòu)建survivin特異性shRNA真核表達載體,同時構(gòu)建survivin非特異性真核表達載體. (2) 實驗分三組:survivin特異性shRNA真核表達載體作用組(轉(zhuǎn)染組)、survivin非特異性真核表達載體作用組(陰性對照組)、未做處理的HL一60細胞組(空白對照組).

7、 (3)用無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒,采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其轉(zhuǎn)染急性粒細胞白血病細胞株HL-60. (4)用臺盼藍拒染法計數(shù)細胞,分別計算轉(zhuǎn)染后24h,48h和72h細胞生長抑制率,觀察SLlrvivin siRNA對細胞生長增殖的影響.' (5)分別在轉(zhuǎn)染后24h、48h、72hL收集各組細胞,TRIZOL法提取蛋白,Western-blot方法測定細胞轉(zhuǎn)染后survivin蛋白變化. (6)利用原位酶標

8、記檢測法(TLJNEL)檢測細胞轉(zhuǎn)染后HL-60細胞的凋亡狀況. (7)所得數(shù)據(jù)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理,計數(shù)資料采用X<'2.檢驗.計量資料統(tǒng)計學數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x±s)表示,多樣本均數(shù)比較采用方差分析.方差不齊時進行變量轉(zhuǎn)換.檢驗標準以P<0.05為有統(tǒng)計學意義. 結(jié)果: (1)經(jīng)酶切鑒定和基因測序證實:survivin特異性及非特異性shRNA真核表達載體與設(shè)計完全一致,所含目的基因序列

9、準確無誤.(2) 臺盼藍細胞增殖計數(shù)的結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染survivin特異性小發(fā)夾RNA真核表達載體后,轉(zhuǎn)染組細胞生長受到明顯抑制,且隨作用時間的延長而增強,其轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h的生長抑制率分別為17.6±8.5﹪、38.3±4.2﹪、44.0±1.2﹪.轉(zhuǎn)染組與陰性對照組和空白對照組生長抑制率相比,作用24h,48h及72h組均有顯著性差異(p<0.01).轉(zhuǎn)染組24小時與48d,時和72小時相比均有顯著性差異(P<0.01)

10、,轉(zhuǎn)染組48h和72h以及空白對照組和陰性對照組各時間段抑制率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05).(3)Western-blot結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染組24h、48h、72h survivin蛋白相對空白對照組表達量分別為0.74±0.01、0.35±0.02、0.34±0.01,陰性對照組分別為0.99±0.02、1.00±0.02、0.99±01,轉(zhuǎn)染組與陰性或空白對照組相比明顯降低(P＜0.01).轉(zhuǎn)染組24h與48h或72h結(jié)果相比存在顯

11、著性差異(P<0.01),48h與72h結(jié)果相比無顯著性差異(P<0.05).(4)TUNEL結(jié)果:轉(zhuǎn)染48h后,轉(zhuǎn)染組、陰性對照組和空白對照組細胞凋亡率分別為31.0﹪、3.33﹪、3.67﹪,轉(zhuǎn)染組明顯高于陰性或空白對照組(P<0.01).結(jié)論:(1) survivin特異性shRNA真核表達載體構(gòu)建成功.(2) 轉(zhuǎn)染survivin特異性shRNA真核表達載體后,可以使HL-60細胞生長和增殖受到抑制.(3) 利用RNA干擾沉默S