極化巨噬細(xì)胞與脊髓來(lái)源神經(jīng)干細(xì)胞聯(lián)合移植對(duì)脊髓損傷治療作用的研究.pdf

1、Ⅰ極化巨噬細(xì)胞對(duì)胚胎脊髓來(lái)源神經(jīng)干細(xì)胞分化及遷移作用的研究
　　脊髓損傷（SCI）后，神經(jīng)元有限的再生能力以及損傷區(qū)不利于神經(jīng)再生的微環(huán)境，使得損傷愈后非常不理想。脊髓損傷后的神經(jīng)干/前體細(xì)胞（NS/PCs）移植，分化而來(lái)的神經(jīng)元替代缺失的神經(jīng)元，促進(jìn)神經(jīng)環(huán)路及運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)，是最具希望的脊髓損傷治療策略。然而損傷區(qū)的微環(huán)境卻促使絕大多數(shù)移植的神經(jīng)干細(xì)胞分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞，而無(wú)法達(dá)到神經(jīng)元替代治療的目的。因此為移植的NS/PCs創(chuàng)造

2、適宜的內(nèi)環(huán)境，是達(dá)到治療目的的重要手段。巨噬細(xì)胞是參與脊髓損傷后炎癥反應(yīng)的重要免疫細(xì)胞，其分泌的多種細(xì)胞因子參與損傷微環(huán)境的調(diào)節(jié)。然而巨噬細(xì)胞的不同極化狀態(tài)決定其功能。我們利用骨髓來(lái)源的M1/M2型極化巨噬細(xì)胞條件性培養(yǎng)基體外培養(yǎng)小鼠胚胎脊髓來(lái)源的NS/PCs。M1型條件培養(yǎng)基（M1-CM）促進(jìn)NS/PCs分化成星形膠質(zhì)細(xì)胞的比例明顯高于對(duì)照組及M2型條件培養(yǎng)基組；相比之下，M2-CM則促進(jìn)NS/PCs分化成更多的神經(jīng)元及少突膠質(zhì)細(xì)胞。

3、將NS/PCs分別與M1或M2巨噬細(xì)胞聯(lián)合移植入正常和損傷的小鼠脊髓后，移植的M1型巨噬細(xì)胞可促進(jìn)NS/PCs向星形膠質(zhì)細(xì)胞方向分化；而M2型巨噬細(xì)胞卻可以使NS/PCs更多的分化為神經(jīng)元及少突膠質(zhì)細(xì)胞，分化的神經(jīng)元可以與宿主神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生整合，促進(jìn)脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。此外，極化的巨噬細(xì)胞與NS/PCs聯(lián)合移植入脊髓后，M1型巨噬細(xì)胞促進(jìn)NS/PCs來(lái)源的細(xì)胞發(fā)生遠(yuǎn)距離遷移，而M2型巨噬細(xì)胞則促進(jìn)NS/PCs來(lái)源的細(xì)胞聚集在損傷區(qū)

4、內(nèi)，上述兩種遷移模式具有趨化因子受體4（CXCR4）依賴性。我們的研究提示：NS/PCs與極化巨噬細(xì)胞聯(lián)合移植可能是脊髓損傷修復(fù)有效的治療策略。
　　Ⅱ脊髓神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞極性的影響
　　巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞是CNS免疫應(yīng)答的主要調(diào)節(jié)細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)移植的NS/PCs具有免疫調(diào)節(jié)功能，但NS/PCs對(duì)脊髓損傷后M1及M2型巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制還不清楚。我們利用 AR-/-、PD1-/-兩種工具鼠在體內(nèi)外觀察脊髓來(lái)源干細(xì)胞對(duì)

5、 M1及 M2型巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)的影響，以了解外源性移植的神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)在體免疫反應(yīng)的調(diào)控及調(diào)控機(jī)制，為CNS損傷的細(xì)胞治療提供理論依據(jù)。
　　在體外將胚胎脊髓來(lái)源NS/PCs與體外極化培養(yǎng)的M1型巨噬細(xì)胞直接接觸混合培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)NS/PCs會(huì)降低CD11b+CD86+M1型巨噬細(xì)胞比例；當(dāng)將體外極化的M1、M2型巨噬細(xì)胞及NS/PCs三者接觸混合培養(yǎng)時(shí)，共培養(yǎng)組CD11b+CD86+M1型巨噬細(xì)胞比例同樣少于對(duì)照組。將NS/PCs移植

6、入AR-/-、PD1-/-小鼠SCI模型損傷區(qū)后1周，發(fā)現(xiàn)NS/PCs移植組脊髓損傷區(qū)iNOS+細(xì)胞比例明顯減少；5周時(shí)NS/PCs移植組 Arg1+細(xì)胞比例多于對(duì)照組，結(jié)果提示 NS/PCs在體內(nèi)免疫應(yīng)答起始階段會(huì)減少CD86+iNOS+的M1巨噬細(xì)胞的數(shù)量，但在損傷后期會(huì)使損傷區(qū)的Arg1+M2型巨噬細(xì)胞聚集，延遲固有免疫應(yīng)答。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)移植NS/PCs能使脊髓損傷區(qū)NeuN+細(xì)胞數(shù)增多，并能有效促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。趨化因子對(duì)脊髓損

7、傷后單核細(xì)胞的浸潤(rùn)具有重要作用，QRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)M1型巨噬細(xì)胞高表達(dá)趨化因子及受體CCR2/MCP-1及CCR5/MIP-1，M1-CM條件培養(yǎng)的NS/PCs低表達(dá)CCR2/MCP-1及CCR5/MIP-1，二者是否通過(guò)調(diào)節(jié)趨化因子的表達(dá)發(fā)揮脊髓損傷后的免疫調(diào)節(jié)作用以及其他可能的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步驗(yàn)證。
　?、笊窠?jīng)干細(xì)胞組織特異性差異的研究
　　盡管神經(jīng)干細(xì)胞已用于多種CNS疾病的移植治療，并取得了一定療效，但神經(jīng)干細(xì)

8、胞的調(diào)控機(jī)制如分化、增殖及在病理狀況下的調(diào)控還不十分清楚。我們體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，CNS不同組織來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞（海馬神經(jīng)干細(xì)胞和脊髓神經(jīng)干細(xì)胞）生長(zhǎng)速度及對(duì)消化酶的耐受能力不同，因此我們首先驗(yàn)證了兩種不同來(lái)源神經(jīng)干細(xì)胞增殖速度的差異，并分析其調(diào)控機(jī)制。細(xì)胞粘附分子是調(diào)控細(xì)胞增殖及分化的重要因素，因此我們檢測(cè)細(xì)胞粘附相關(guān)分子在不同來(lái)源干細(xì)胞及在損傷和正常干細(xì)胞中的表達(dá)情況，目的是探討調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞組織特異性及脊髓神經(jīng)干細(xì)胞特性

9、的重要調(diào)控機(jī)制，為脊髓損傷治療尋找新的出路。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同時(shí)期脊髓來(lái)源干細(xì)胞Ki67+、BrdU+及PHH3+細(xì)胞數(shù)少于海馬干細(xì)胞，結(jié)果提示脊髓干細(xì)胞增殖速度慢于海馬來(lái)源干細(xì)胞；損傷脊髓干細(xì)胞 Ki67+及 BrdU+細(xì)胞數(shù)多于正常脊髓干細(xì)胞，說(shuō)明組織損傷可以加快神經(jīng)干細(xì)胞的增殖；免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)脊髓干細(xì)胞細(xì)胞粘附相關(guān)分子如N-cadherin、β-catenin、RhoA、Pax6表達(dá)強(qiáng)于海馬干細(xì)胞，它們?cè)谡{(diào)控干細(xì)胞的粘附、增殖及其他生