K-ras基因?qū)Y腸癌轉移相關蛋白調(diào)節(jié)機制的研究.pdf

1、本研究旨在從細胞黏附和移動角度探討K-ras對結腸癌轉移的影響及相關信號傳導途徑，并結合臨床資料進行分析。 研究目的： 1．在細胞水平研究K-ras對結腸癌細胞遷移能力的影響。 2．進一步探討K-ras對腫瘤轉移相關蛋白的調(diào)節(jié)及信號傳導途徑。 ①K-ras 對細胞黏附的作用：研究 K-ras 對E-cadherin/β-catenin/P120-catenin復合體的影響②K-ras對細胞遷移的作用：研究

2、K-ras對RhoA功能的影響③加入P13K/Akt途徑抑制劑和MAPK途徑抑制劑研究K-ras調(diào)節(jié)腫瘤轉移相關蛋白的信號傳導途徑。 3．將細胞水平研究所得結論應用于組織水平，在臨床標本中初步探討K-ras突變與β-catenin蛋白及轉移的關系。 材料與方法： 選取人結腸癌Caco-2細胞，其K-ras基因為野生型。將突變型K-ras質(zhì)粒(prh-K-ras<'Val12>)用脂質(zhì)體Lipofectamine

3、<'TM> 2000轉染入細胞，同時選取空質(zhì)粒(prh-GFP)轉染作為陰性對照。采用P13K/Akt途徑特異性抑制劑LY294002(50μmol/L)和MAPK途徑特異性抑制劑 PD98059(20μmol/L)抑制相應信號通路。采用Transwell細胞遷移實驗觀察K-ras基因轉染對結腸癌 Caco-2細胞遷移能力的影響；免疫熒光染色和免疫沉淀實驗檢測 K-ras基因轉染對Caco-2細胞膜上E-cadherin/β-caten

4、in/P120-catenin復合體各組分的影響；Pull-Down實驗檢測K-ras基因轉染后RhoA蛋白活性的改變；選取31例結腸腺癌手術標本，PCR-測序方法檢測 K-ras突變情況，免疫組化檢測β-catenin蛋白的表達變化，同時了解患者術后一年內(nèi)有無轉移，分析K-ras突變與轉移及E-cadherin、β-catenin表達的關系。 實驗結果： 1．Transwell實驗，K-ras基因轉染后細胞遷移率為19

5、.8±5.6％，與空質(zhì)粒轉染組遷移率14.0±4.2％比有統(tǒng)計學差異(p=0.000，P<0.05)，K-ras基因轉染后加入P13K/Akt途徑抑制劑(LY294002)組為17.5±2.8％，加入MAPK途徑抑制劑(PD98059)組為15.8±1.2％。 2．免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)定位于Caco-2細胞膜的E-cadhefin、β-catenin蛋白在K-ras轉染后減少；免疫沉淀證明K-ras轉染后Caco-2細胞中與E-c

6、adhefin結合的β-catenin蛋白的量減少；這一下調(diào)作用可被P13K/Akt途徑抑制劑抑制LY294002所抑制，而不被MAPK途徑抑制劑PD98059抑制； Western-Blot檢測到K-ras轉染后Caco-2細胞中E-cadherin蛋白表達量無明顯改變，但P120-catenin蛋白量減少，但免疫沉淀未檢測到P120-catenin蛋白。 3．蛋白功能Pull-Down實驗證明K-ras轉染后RhoA活性明顯

7、增強，這一作用不被P13K/Akt途徑或MAPK途徑抑制劑抑制。 4．31例結腸癌手術標本組織中PCR擴增檢測K-ras第一外顯子突變率46.2％1有14例可觀察到β-catenin染色與正常粘膜比胞膜表達下降、胞漿表達增加，陽性率為48.3％；其中5例為術后一年內(nèi)即發(fā)現(xiàn)轉移者，有轉移的標本中K-ras突變率為60％(3/5)，無轉移的標本中K-ras突變率為42.8％(9/21)；有轉移的標本中β-catenin胞膜表達下降陽

8、性率為60％(3/5)，無轉移的標本中β-catenin陽性率為45.8％(11/24)。 結論： 1．K-ras基因可以促進結腸癌Caco-2細胞的遷移。 2．這一作用是通過減少細胞膜上的黏附復合體E-cadherin/β-catenin/P120-catenin和增加細胞內(nèi)RhoA的活性實現(xiàn)的，這一作用可部分通過P13K/Akt途徑介導。 3．在臨床標本中，K-ras突變有增加結腸癌術后第一年腫瘤轉移