Notch信號在牙髓損傷修復中的作用研究.pdf

1、牙齒發(fā)生和牙髓損傷修復均受到眾多信號分子的精密調控。前期研究表明，Notch信號通路在進化上高度保守，它可以通過局部細胞間相互作用傳導信號，調控細胞的增殖、分化、凋亡等多種生命過程，最終決定多細胞動物發(fā)育過程中多種細胞的命運。本研究擬從體外、體內兩方面進行實驗。首先利用致齲菌的毒力因子脂多糖LPS刺激小鼠成牙本質細胞樣細胞系MDPC-23，從而探討成牙本質細胞在受到外界致齲菌毒力因子刺激下其Notch相關基因的表達情況。接著，通過構建大

2、鼠牙髓炎模型，從而探討Notch受體在牙髓損傷修復過程中的動態(tài)表達模式。最后，我們通過抑制Notch信號繼而探討其對成牙本質樣細胞分化的影響。
　　所取得的研究結果如下：
　　1.牙髓損傷細胞模型建立及NOTCH信號表達檢測
　　1)牙髓損傷細胞模型的建立
　　利用不同濃度的LPS刺激MDPC-23細胞系，并進行MTT檢測。結果表明，當LPS濃度超過1μg/ml且對MDPC-23細胞作用72h時，表現(xiàn)為毒性作用。

3、24h后，各濃度LPS對細胞增殖有明顯促進作用（P<0.05）。48h后，10ng/ml～1μg/ml組與對照組相比沒有明顯區(qū)別（P>0.05），5μg/ml組對細胞增殖有顯著的抑制作用（P<0.05）。72h后，各實驗組與對細胞增殖均為抑制作用，其中1μg/ml和5μg/ml組抑制作用顯著（P<0.05）。通過對細胞增殖活力的檢測，初步確定了合適的LPS濃度，為進一步的研究打下了基礎。
　　2)LPS刺激對MDPC-23細胞中N

4、otch信號相關基因表達的影響
　　利用合適濃度的LPS刺激MDPC-23細胞系，進行Real-timePCR檢測。結果顯示，在對照組中，Notch1表達平穩(wěn)并呈輕微上升趨勢，當用10ng/ml～1μg/ml的LPS作用后，Notch1的表達先升高，而后逐漸下降。Jagged1和Delta1在對照組中均表現(xiàn)出下降趨勢；Jagged1加入100ng/ml～1μg/mlLPS后，1～3d表達為上升趨勢，3～5d表達為下降趨勢；Delt

5、a1在加入10ng/ml～1μg/ml的LPS后表現(xiàn)為0～3d表達逐漸下降，3～5d逐漸上升。Hes1在對照組中表達先輕微上升而后基本平穩(wěn)；當加入10ng/m和100ng/ml的LPS后，0～5d表達逐漸升高；當加入1μg/ml的LPS時，0～1d表達逐漸升高，而1～5d逐漸下降。通過對Notch相關基因表達量的研究，探討在牙髓損傷修復中各基因的動態(tài)變化，我們得出結論，一定濃度LPS刺激可使MDPC-23中Notch信號分子表達升高，N

6、otch信號通路在維系細胞功能平衡、啟動細胞應激反應有重要意義。
　　2.Notch受體在牙髓損傷動物模型中的動態(tài)表達分析
　　通過構建大鼠實驗性牙髓炎模型，我們探討了Notch2的表達情況，牙髓損傷早期（3d），牙髓細胞中Notch2呈弱陽性表達，成牙本質細胞陰性表達。牙髓損傷中期（5d），成牙本質細胞深層細胞Notch2陽性表達達到高峰。牙髓損傷晚期（7d），Notch2在牙髓細胞中表達減弱，而在成牙本質細胞中表達高峰。

7、牙髓損傷末期（14d），Notch2僅在成牙本質細胞下層細胞中尚有微弱表達，而其余牙髓細胞均為陰性表達。而對于LPS刺激組，3d～7d內Notch2染色程度均明顯高于單純機械損傷組。對照組正常牙髓組織Notch2表達為陰性。通過體內試驗我們得出，機械損傷可以誘導Notch2在牙髓間充質細胞和成牙本質細胞中表達，同時LPS的刺激作用可以加劇應激反應并提高Notch2的表達水平。Notch信號對牙髓損傷修復起到了重要作用。
　　3.抑

8、制Notch信號對小鼠牙乳頭細胞系MDPC-23分化潛能影響的初步分析。
　　為了進一步說明Notch信號對牙乳頭細胞向成牙本質細胞分化中起到的作用，我們對小鼠牙乳頭細胞系MDPC-23進行礦化誘導，并向誘導液中加入不同濃度的Notch信號抑制劑DAPT，從而觀察在Notch信號被抑制的條件下MDPC-23細胞的堿性磷酸酶表達變化以及形成礦化結節(jié)的改變。結果顯示，DAPT抑制Notch信號后，MDPC-23細胞的ALP活性及礦化結

9、節(jié)形成能力均有所降低。這些結果提示，Notch信號的存在可能有助于促進MDPC-23細胞分化。
　　綜上所述，牙齒發(fā)育中細胞的多樣性是以Notch信號所介導的旁側分化為基礎的，當成牙本質細胞在牙髓受到損傷時發(fā)生凋亡，此時牙髓間充質細胞就會開始啟動自我分化并逐漸形成新生的成牙本質樣細胞，繼而分泌形成修復性牙本質。Notch信號通路可以在牙髓損傷修復動態(tài)過程中激活表達，體現(xiàn)了一種在組織修復過程早期的分子反應機制。本研究認為，在體外細胞

10、實驗中發(fā)現(xiàn)Notch受體以及配體Jagged1對細胞分化具有負向調節(jié)作用，而配體Delta1則對細胞分化具有正向調節(jié)作用。同時，抑制Notch信號可以降低MDPC-23細胞的礦化形成能力，即抑制了其向成牙本質樣細胞分化的能力。體內研究中發(fā)現(xiàn)，牙髓受到刺激后，Notch的表達強度呈現(xiàn)出隨時間的動態(tài)變化，體現(xiàn)了Notch首先對外界急性刺激的一個應激反應，產生對成牙本質細胞的一個保護性的抑制凋亡的作用。本研究認為，Notch信號的再激活對于平