人參皂甙Rg3聯(lián)合三氧化二砷對肝癌裸鼠抗腫瘤作用與機(jī)制.pdf

1、研究背景與目的:肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，隨著科技的發(fā)展，小肝癌的發(fā)現(xiàn)日益增多，但臨床上發(fā)現(xiàn)的肝癌大部分仍是中晚期，非手術(shù)治療成為重要的治療手段，中藥抗腫瘤的作用與機(jī)制正逐漸被現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究所揭示。任何抗癌藥單獨(dú)應(yīng)用，療效總是有限的，通過過分提高劑量，可提高一定療效，但明顯增強(qiáng)藥物毒性，因此臨床多主張聯(lián)合用藥，其目的在于提高療效，減弱毒性，延緩或防止耐藥。三氧化二砷對肝癌細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的作用在實(shí)驗(yàn)室已得到證實(shí)，也有用于中晚期肝癌的報(bào)

2、道。人參皂甙Rg3抗腫瘤作用主要為其具有抑制腫瘤新生血管形成，從而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。人參皂甙Rg3動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，能明顯提高正常小鼠和荷瘤小鼠的免疫功能，與化療藥合用有明顯的減毒增效作用，可延長荷瘤小鼠的生存期。本實(shí)驗(yàn)研究人參皂甙Rg3聯(lián)合三氧化二砷對肝癌裸鼠移植瘤模型的抗腫瘤作用，并深入探討其抗腫瘤的機(jī)制，為將人參皂甙Rg3聯(lián)合三氧化二砷聯(lián)合應(yīng)用于臨床治療肝癌，提供更堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)，為控制肝癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、延長生存時(shí)

3、間，探索新的治療途徑。 方法(1)采用人肝癌Bel-7402細(xì)胞株，種植于32只雄性裸鼠皮下，隨機(jī)均分成8組：Rg3(5mg/kg，10mg/kg，20mg/kg)聯(lián)合三氧化二砷組，Rg3組(5mg/kg，10mg/kg，20mg/kg)，三氧化二砷組及對照組。實(shí)驗(yàn)自腫瘤接種第3天開始，人參皂甙Rg3，隔日灌胃，共20次，三氧化二砷，每日腹腔內(nèi)注射，連續(xù)28天，停藥一周后，脫頸處死，分別觀察裸鼠的生存質(zhì)量及毒副反應(yīng)，有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移

4、，檢測腫瘤的重量，計(jì)算抑瘤率。 (2)采用羊抗兔免疫球蛋白-過氧化物酶二步法免疫組織化學(xué)法(PowerVisionTMTwo-StepHistostaining)，結(jié)合計(jì)算機(jī)圖像分析，檢測聯(lián)合用藥組，Rg3組，三氧化二砷組及對照組中，Bax，Bcl-2，PCNA，血管第Ⅷ因子在裸鼠肝癌移植瘤組織中的表達(dá)情況，并計(jì)數(shù)微血管密度(MVD)。 結(jié)果(1)觀察人參皂甙Rg3與三氧化二砷對荷瘤裸鼠生存質(zhì)量及毒副反應(yīng)的作用，本研究發(fā)

5、現(xiàn)，Rg3組裸鼠未見明顯的藥物毒副反應(yīng)，生存質(zhì)量最好，其次為聯(lián)合治療組，再次為對照組，而三氧化二砷組有藥物反應(yīng)，生存質(zhì)量較差，三氧化二砷組有1只死亡。本實(shí)驗(yàn)中較為突出的表現(xiàn)是聯(lián)合治療組的毒副反應(yīng)和生存質(zhì)量明顯優(yōu)于三氧化二砷治療組，隨著人參皂甙Rg3濃度的增加，及作用時(shí)間的延長，聯(lián)合治療組裸鼠的生存質(zhì)量顯著提高。 (2)形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)：Rg3組，聯(lián)合用藥組腫瘤表面呈蒼白色，僅有少數(shù)幾條肉眼可見血管，而對照組及三氧化二砷組瘤體表面的

6、血管較多，在我們對腫瘤進(jìn)行剝離時(shí)，可見Rg3組及聯(lián)合用藥組血供明顯減少，出血量少，并且隨著Rg3用藥濃度的增加，血供的減少更為明顯。對照組血供最為豐富，出血量多。 在光學(xué)顯微鏡下觀察，聯(lián)合治療組的裸鼠腫瘤具有多灶性大面積壞死區(qū)，而三氧化二砷組腫瘤僅有小面積壞死區(qū)，聯(lián)合治療組的腫瘤壞死情況明顯高于三氧化二砷組。 HE染色光鏡下觀察肝、肺，淋巴結(jié)等器官，各組均未見明顯遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。 (3)Rg3組抑瘤率隨著濃度的升高，呈

7、現(xiàn)一個(gè)逐漸升高的趨勢。Rg3組，三氧化二砷組，聯(lián)合組，平均瘤重明顯較對照組輕，差異有顯著性(P＜0.001)。三氧化二砷組抑瘤率高于Rg3組，但隨著Rg3濃度的升高，二者之間的差異明顯減小；聯(lián)合組平均瘤重最低，抑瘤率最高，其抑瘤作用高于三氧化二砷組，差異有顯著性(P＜0.05)。 (4)微血管密度(MVD)在裸鼠肝癌移植瘤組織中的表達(dá)，Rg3組，三氧化二砷組，聯(lián)合組明顯低于對照組，差異有顯著性(P＜0.001)。Rg3組高于三氧

8、化二砷組，差異有顯著性(P＜0.05)，Rg3組與聯(lián)合組無顯著差異(P＞0.05)。聯(lián)合組抑制新生血管生成的作用最強(qiáng)，聯(lián)合組作用高于三氧化二砷組，差異有顯著性(P＜0.05)。 (5)PCNA陽性細(xì)胞指數(shù)(PI)在裸鼠肝癌移植瘤組織中的表達(dá)，Rg3組PI低于對照組，差異有顯著性(P＜0.05)，隨著藥物濃度的升高，差異更加明顯。三氧化二砷組和聯(lián)合用藥組明顯低于對照組(P＜0.001)。三氧化二砷組PI低于Rg3組，差異有顯著性(

9、P＜0.05)，隨著Rg3藥物濃度的升高，差異逐漸減小。聯(lián)合組PI值最低，且與三氧化二砷組差異有顯著性(P＜0.05)。 (6)通過免疫組化監(jiān)測腫瘤組織中Bax，Bcl-2蛋白表達(dá)，來研究二者對移植瘤肝癌細(xì)胞凋亡的影響。本實(shí)驗(yàn)顯示，對照組bax蛋白的表達(dá)強(qiáng)度最低，Bcl-2蛋白的表達(dá)強(qiáng)度最高，腫瘤處于一種不斷生長的趨勢。三氧化二砷組上調(diào)Bax，下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，作用高于Rg3組，聯(lián)合組Bcl-2值最低，Bax值最高，隨著

10、Rg3藥物濃度的升高，聯(lián)合組的效果更為明顯。 結(jié)論1.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，人參皂甙Rg3具有顯著的抑制腫瘤新生血管形成的作用，其抑制腫瘤生長可能主要是通過抑制腫瘤血管生成來實(shí)現(xiàn)的，而三氧化二砷對腫瘤血管生成抑制作用較Rg3弱，作為抗腫瘤藥，主要通過誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡，抑制肝癌細(xì)胞的增殖，來抑制腫瘤生長。 2.本實(shí)驗(yàn)證明，在裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，人參皂甙Rg3與三氧化二砷聯(lián)合應(yīng)用，可以顯著的抑制人肝癌裸鼠移植瘤的生長，其主要作用機(jī)制