外源性基因經(jīng)乳腺管注射在大鼠乳腺中表達(dá)的機(jī)理研究.pdf

1、乳腺生物反應(yīng)器屬于轉(zhuǎn)基因動物的范疇，自轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)立以來，幾十年里取得了巨大進(jìn)展，擁有著廣闊的應(yīng)用前景。從轉(zhuǎn)基因動物的乳腺中獲得珍貴醫(yī)用人類蛋白質(zhì)是現(xiàn)代生物技術(shù)學(xué)應(yīng)用的重要領(lǐng)域。乳腺導(dǎo)管注射可以用來制作乳腺生物反應(yīng)器，本實驗的目的是為了研究外源性基因經(jīng)乳腺導(dǎo)管注射在大鼠乳腺中表達(dá)的機(jī)理，探索提高基因轉(zhuǎn)染效率的對策。 本實驗的研究內(nèi)容分為三個部分。 在第一部分實驗中，取8個不同發(fā)育時間點(4周齡、9周齡未孕、妊娠7天、妊娠

2、12天、妊娠18天、產(chǎn)后1周、產(chǎn)后2周、產(chǎn)后3周)的雌性大鼠乳腺組織進(jìn)行普通石蠟切片、HE染色，在光鏡下觀察其形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：大鼠的乳腺是復(fù)管泡腺，其發(fā)育過程中形態(tài)學(xué)變化最明顯的時間是在妊娠12天至產(chǎn)后14天，表現(xiàn)為大量漿液性腺泡的腺細(xì)胞不斷增生及分泌活動，其中在妊娠12天和產(chǎn)后1周可以發(fā)現(xiàn)數(shù)量相對較多的處于分裂期的腺細(xì)胞。大鼠的乳腺發(fā)育過程主要是在孕期和泌乳期完成的，發(fā)育隨妊娠的開始而進(jìn)行，隨泌乳的結(jié)束而退化。另取同一發(fā)育時期的

3、大鼠乳腺制作卡紅染色的全組織片，觀察了乳腺導(dǎo)管在發(fā)育過程中的整體變化。發(fā)現(xiàn)4周齡時，大鼠乳腺主要由細(xì)長而稀疏的導(dǎo)管構(gòu)成，導(dǎo)管極少有側(cè)枝；9周齡時乳腺導(dǎo)管的主干上發(fā)出較多側(cè)枝，并且末端出現(xiàn)端芽；妊娠后，乳腺導(dǎo)管增粗，側(cè)枝更加密集，末球出現(xiàn)并逐漸增多；產(chǎn)后，乳腺導(dǎo)管基本維持在妊娠末期的形態(tài)特點；哺乳結(jié)束后乳腺導(dǎo)管恢復(fù)成妊娠前的狀態(tài)。 第二部分進(jìn)行了外源性基因在體外培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)的實驗，外源性基因選擇的是pCE-29質(zhì)粒，它是高效的綠

4、色熒光蛋白(GFP)真核表達(dá)載體。實驗中首先擴(kuò)增已轉(zhuǎn)染有pCE-29質(zhì)粒的DH5α細(xì)菌，而后采取抽提的方法，得到含pCE-29質(zhì)粒的溶液。經(jīng)過紫外/可見分光度計測得溶液濃度為5.288ug/ul，純度為1.8240(A260/A280)，符合基因轉(zhuǎn)染的實驗要求。質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶XbaⅠ酶切，所得產(chǎn)物在0.8％瓊脂糖凝膠中電泳，電泳后的結(jié)果表明：質(zhì)粒結(jié)構(gòu)完整、序列正確；而后利用NucleofectoTMManual轉(zhuǎn)染儀對處于指數(shù)生長期

5、的小鼠乳腺癌細(xì)胞MA782進(jìn)行了質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，結(jié)果培養(yǎng)細(xì)胞可以表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)。提示在體外條件下，對于一個細(xì)胞群體而言，如果其中處于分裂期的細(xì)胞較多，那么可能這一細(xì)胞群體接受外源基因的機(jī)率也較大。 在第三部分的實驗中，依據(jù)乳腺發(fā)育時期的不同(即未孕、妊娠7天、妊娠12天、妊娠18天、產(chǎn)后1周、產(chǎn)后2周)將36只雌性SD大鼠分為6個實驗組(6只/組)，以質(zhì)粒pCE-29與脂質(zhì)體Invivo-jetPEITM依不同比例混合后制

6、成不同的轉(zhuǎn)染液，分別經(jīng)乳腺管注射和乳腺組織直接注射兩種方式導(dǎo)入各組大鼠的不同乳腺，48小時后處死大鼠，取材、冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察各組大鼠乳腺中GFP的表達(dá)情況。如果有GFP表達(dá)則對該張冰凍切片再進(jìn)行HE染色，通過前后圖像對比來準(zhǔn)確定位GFP的表達(dá)位置。結(jié)果在妊娠12天和產(chǎn)后1周這兩組中，pCE-29質(zhì)粒與脂質(zhì)體Invivo-jetPEITM依(N/P=10)的比例混合后經(jīng)乳腺導(dǎo)管注射，質(zhì)?？梢赞D(zhuǎn)入腺泡細(xì)胞中而得到表達(dá)，而經(jīng)乳腺組織

7、直接注射的實驗對象中未發(fā)現(xiàn)有GFP的表達(dá)。分析以上結(jié)果，認(rèn)為采用乳腺注射進(jìn)行轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灂r，為提高外源基因的轉(zhuǎn)染效率可能應(yīng)關(guān)注以下幾個方面：1、基因轉(zhuǎn)染的時機(jī)：可能應(yīng)選擇乳腺內(nèi)細(xì)胞分裂活動旺盛的時期。2、乳腺干細(xì)胞的影響：可能應(yīng)選擇在干細(xì)胞/祖細(xì)胞不斷分化的時期。3、轉(zhuǎn)染液中DNA與脂質(zhì)體的配比：應(yīng)根據(jù)轉(zhuǎn)染對象的不同選擇外源基因與脂質(zhì)體的合適配比。4、外源基因?qū)氲耐緩剑航?jīng)乳腺導(dǎo)管導(dǎo)入可能相對于乳腺組織直接注射效果更佳。5、乳腺中不同種類

8、細(xì)胞的特性：可能乳腺中的不同細(xì)胞對外源基因的易感性是不同的。 本實驗首次對外源基因經(jīng)乳腺導(dǎo)管注射在乳腺細(xì)胞中表達(dá)的機(jī)制進(jìn)行了研究，提出了當(dāng)乳腺細(xì)胞處于旺盛分裂增殖的起始階段時，可能這些不斷分裂的細(xì)胞接受外源性基因的機(jī)率較大，這些細(xì)胞可能來源于腺細(xì)胞中的干細(xì)胞或者祖細(xì)胞。在轉(zhuǎn)基因的體內(nèi)實驗研究中創(chuàng)新性的采用了對同一切片不同狀態(tài)下的圖像進(jìn)行圖像分析來精確判定基因表達(dá)結(jié)果的新方法。實驗中首先將新鮮冰凍組織切片在熒光顯微鏡熒光激發(fā)下觀察