骨髓源性心肌干細胞的篩選及其體外向心肌細胞的誘導(dǎo)分化.pdf

1、目的:建立骨髓間充質(zhì)干細胞(MMSC)的單細胞克隆,篩選具有特異性心肌分化潛能的骨髓源性心肌干細胞(MCSC),在體外采用5-Aza誘導(dǎo)MCSC向心肌定向分化,探討5-Aza誘導(dǎo)MCSC向心肌分化過程中心肌特異性結(jié)構(gòu)蛋白的表達變化和超微結(jié)構(gòu).方法：取成年雄性SD大鼠的骨髓細胞,進行原代培養(yǎng)和單細胞克隆培養(yǎng).通過c-kit免疫細胞化學(xué)標(biāo)記和RT-PCR檢測,篩選出具有特異性心肌分化潛能的MCSC.然后,用5-Aza誘導(dǎo)MCSC向心肌定向分

2、化.在相差顯微鏡下觀察分化后細胞的形態(tài)變化和c-kit表達,用RT-PCR檢測誘導(dǎo)前后心肌特異性基因表達的變化.取分化后不同時間的細胞作cTnT免疫細胞化學(xué)染色,并對cTnT的光密度值作圖像分析.透射電鏡下觀察分化細胞的超微結(jié)構(gòu).取不同發(fā)育期和成熟期SD大鼠的心肌組織作對比研究.結(jié)果：骨髓中含有多種MMSC克隆,以不同形態(tài)和大小的成纖維細胞樣克隆數(shù)目最多.成纖維細胞樣和扁平多角形細胞克隆呈c-kit免疫染色強陽性,且表達早期心肌形成轉(zhuǎn)錄

3、因子Nkx2.5.經(jīng)體外擴增后獲得MCSC.用5-Aza誘導(dǎo)后,MCSC的形態(tài)和排列方式發(fā)生變化.誘導(dǎo)后1周,細胞呈長梭形平行排列,c-kit表達轉(zhuǎn)為陰性;第2周,細胞變?yōu)槎讨鶢?細胞內(nèi)開始表達cTnT;第3周,相鄰細胞間出現(xiàn)細胞連接,細胞內(nèi)檢測到MLC-2v mRNA表達,cTnT表達增強,可見橫紋樣結(jié)構(gòu);第4周,多個細胞相互連接形成肌管樣結(jié)構(gòu),并可觀察到肌管的自發(fā)性搏動,MLC-2v mRNA表達增強,cTnT表達明顯,橫紋增多,但

4、排列不規(guī)則.電鏡下可見誘導(dǎo)后4周的細胞內(nèi)出現(xiàn)心房粒,含有豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、糖原和散在的肌絲.在胚胎第11天鼠的心肌內(nèi),橫紋樣結(jié)構(gòu)較少且排列不規(guī)則.新生鼠心肌內(nèi)橫紋增多,排列較規(guī)則.1月齡和3月齡大鼠心肌的橫紋樣結(jié)構(gòu)發(fā)達,排列規(guī)則.結(jié)論：骨髓中含有多種干細胞克隆.該實驗從MMSC克隆中篩選了具有心肌特異性分化潛能的MCSC,這將為臨床干細胞移植治療心肌梗死提供理想的干細胞來源.在5-Aa誘導(dǎo)下MCSC可分化為心肌細胞.誘導(dǎo)分化后4周,細胞