大鼠脊髓損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細胞增殖過程中Wnt-1表達的實驗研究.pdf

1、脊髓損傷（Spinal cord injury，SCI）的治療一直是困擾全人類的一個難題，尤其是伴隨著現(xiàn)代社會的快速發(fā)展和人們生活節(jié)奏的日益加快，各種創(chuàng)傷導(dǎo)致的脊髓損傷的發(fā)生率逐年攀升。據(jù)統(tǒng)計我國每年有脊髓損傷病人約5萬人，且以每年10%的速度不斷上升。由于脊髓損傷較高的致殘率，且大多數(shù)患者需要長期住院治療和康復(fù)，給家庭社會帶來了沉重的負擔。人們嘗試過無數(shù)治療脊髓損傷的方法，但都不大理想。近年來，隨著神經(jīng)病理生理及神經(jīng)發(fā)育學(xué)研究的不斷深

2、入，神經(jīng)組織不能再生的傳統(tǒng)觀念受到了挑戰(zhàn)。尤其是神經(jīng)干細胞（Neural stem cells，NSCs）的發(fā)現(xiàn)和證實，為治療包括脊髓損傷在內(nèi)的難治性中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Center neural system，CNS）疾病開辟了新的道路。 神經(jīng)干細胞具有分化為神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞的能力，并具有很強的自我更新能力和增殖潛能，因此具有非常重要的理論研究和臨床應(yīng)用價值。通過移植大量的細胞特別是神經(jīng)干細胞來促進損傷脊髓的功能恢

3、復(fù)已經(jīng)取得了令人鼓舞的結(jié)果，但誘導(dǎo)動員內(nèi)源性神經(jīng)干細胞來修復(fù)脊髓損傷方面的研究關(guān)注較少；與移植細胞相比，激活內(nèi)源性神經(jīng)干細胞因是利用自身資源，它不僅克服了從組織獲取神經(jīng)干細胞的危險性和局限性，也避免了組織細胞移植中存在的倫理、免疫排斥、來源有限等問題，因此在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和神經(jīng)退行性疾病領(lǐng)域?qū)袕V闊的應(yīng)用前景。 雖然神經(jīng)干細胞的研究取得了一定的進展，但對內(nèi)源性神經(jīng)干細胞仍了解很少，尤其是對其體內(nèi)的調(diào)控機制仍不明確。因此，

4、在本研究中，利用BrdU/Nestin標記內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的方法，我們觀察了大鼠脊髓損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細胞增殖過程及Wnt-1表達的規(guī)律，探討了大鼠脊髓損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細胞自我增殖變化規(guī)律及其可能機制。此外，鑒于Wnt/β-Catenin信號通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和神經(jīng)干細胞的增殖分化中起了重要作用，我們探索了是否應(yīng)用氯化鋰能提高脊髓損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的增殖。 第一部分大鼠脊髓損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細胞增殖過程中Wnt-1的

5、表達。 目的： 探討大鼠脊髓損傷后信號蛋白Wnt-1的表達及其與脊髓內(nèi)源性神經(jīng)干細胞（ENSCs）早期增殖的關(guān)系。 材料及方法： （一）雌性SD大鼠50只，隨機均分為正常對照組（A組）、損傷組（B組）。 （二）A組僅暴露椎板，B組采用經(jīng)典的Allen法建立脊髓損傷模型。 （三）于損傷后1天、3天、1周、2周、4周進行取材，對距離損傷中心5mm的脊髓行免疫組化染色，檢測ENSCs的增殖及Wn

6、t-1蛋白表達的動態(tài)變化，統(tǒng)計分析二者之間的相關(guān)性。 結(jié)果： A組：可見脊髓外周及室管膜區(qū)域極少數(shù)細胞呈BrdU/Nestin陽性，排列稀疏.灰白質(zhì)中幾乎無BrdU/Nestin陽性細胞。與A組相比較，B組BrdU/Nestin陽性細胞在損傷后1d明顯減少，3d后開始增加，并超出A組水平，主要見于損傷脊髓組織周圍及室管膜區(qū)，灰質(zhì)和白質(zhì)中出現(xiàn)散在點片狀和絲狀表達，7d時BrdU/Nestin陽性細胞數(shù)達到高峰。BrdU/

7、Nestin陽性細胞主要見于室管膜以及環(huán)繞脊髓的軟膜，并向脊髓中央延伸。14d時BrdU/Nestin陽性細胞開始下降，28d后明顯下降。 A組中僅見極少量Nestin的表達。B組在損傷后1d可見少量Nestin表達，3d時開始增加，7d時可見較多Nestin陽性面積的表達，主要分布于室管膜周圍區(qū)域及灰質(zhì)中，14d時開始逐漸減少，28d后Nestin陽性細胞明顯減少。Nestin表達陽性的樹狀突起延伸至灰質(zhì)，在灰質(zhì)中的表達主要

8、分布于神經(jīng)元附近和血管周圍，個別細胞形態(tài)類似星形膠質(zhì)細胞，同時在灰質(zhì)偶見少量類似神經(jīng)元樣Nestin陽性細胞。A組脊髓組織內(nèi)Wnt-1無明顯表達。與A組相比，B組各時間點均可見Wnt-1的表達。1d時就可見脊髓中央管周圍及外膜Wnt-1表達陽性區(qū)域的出現(xiàn)，脊髓灰白質(zhì)內(nèi)少量表達，較為分散，3d后陽性區(qū)域的面積達高峰，7d時維持在較高水平，之后逐漸減少，28d后僅見極少量Wnt-1陽性表達。 結(jié)論： 正常大鼠脊髓中存在著有增

9、殖能力的內(nèi)源性神經(jīng)干細胞，它們保持增生活性狀態(tài)，在損傷后明顯被激活，從而快速增殖，這一過程發(fā)生的機制可能與Wnt信號通路有關(guān)。 第二部分：氯化鋰對大鼠脊髓損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的影響。 目的：探討氯化鋰對大鼠脊髓損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的影響。 方法：75只成年雌性SD大鼠，隨機分為正常對照組（A組）、單純損傷組（B組）、損傷后氯化鋰治療組（C組）。A組僅行椎板暴露，B組和C組采用經(jīng)典的Allens法在T10段制作

10、急性脊髓損傷模型，C組于損傷后1小時給予氯化鋰治療，每日3mmol/Kg腹腔注射，直至取材；B組以相同的方法給予等量生理鹽水。各組分別于損傷后1d、3d、1周、2周、4周進行Brdu腹腔注射標記，共3次，最后一次標記后4小時取材，對距離損傷中心5mm處的脊髓進行Brdu、β-Catenin的免疫組化檢測，圖像分析軟件進行Brdu陽性細胞計數(shù)及β-Catenin陽性表達面積的計算。 結(jié)果：A組脊髓中央管周圍及外膜可見少量Brdu陽

11、性細胞，幾乎無β-Catenin陽性表達。B組脊髓損傷后24小時即可見多量Brdu陽性細胞及微量β-Catenin的表達，1周時兩者達到高峰，主要見于損傷脊髓周圍的灰質(zhì)和室管膜區(qū)，2周后明顯開始減少，4周時僅可見少量Brdu陽性細胞及β-Catenin的陽性表達。C組Brdu陽性細胞及β-Catenin的表達在脊髓損傷后24小時與B組無顯著性差異，1周時在中央管周圍、外膜、灰質(zhì)中Brdu陽性細胞數(shù)及β-Catenin的表達量明顯較B組多

12、，至2周時仍處于較高水平，4周時仍有多量Brdu陽性細胞及β-Catenin的表達。 結(jié)論：氯化鋰在大鼠脊髓損傷后能促進內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的增殖，其機制與Wnt信號通路有關(guān)。 小結(jié)： 1.正常大鼠脊髓中存在內(nèi)源性的神經(jīng)干細胞，他們處于“靜止”或“休眠”狀態(tài)，在損傷等特定因素的作用下其分裂、分化的潛能被激活，從而出現(xiàn)增殖現(xiàn)象。 2.脊髓損傷后，伴隨著內(nèi)源性神經(jīng)干細胞增殖能力的逐漸增強，Wnt-1的表達也逐步增