健骨顆粒對成骨細胞分化影響的實驗研究.pdf

1、一、目的 本課題以成骨細胞分化作為切入點，通過研究成骨細胞分化過程中的敏感指標核心結合因子（Cbfal）、Osterix（OSX）、骨鈣素（OCN）、堿性磷酸酶（AKP）、Ⅰ型膠原（ColⅠ）及其產物羥脯氨酸（HYP）和礦化結節(jié)的變化，旨在探討補腎健脾中藥——鍵骨顆粒對成骨細胞分化的干預作用，為中醫(yī)藥防治骨質疏松癥提供客觀的依據。 二、方法 1建立成骨細胞體外培養(yǎng)體系：原代細胞用酶消化法從新生SD大鼠顱蓋骨獲取，

2、經堿性磷酸酶染色鑒定后，取第三、四代細胞進行實驗。 2健骨顆粒含藥血清制備：取3月齡清潔級雄性SD大鼠20只，隨機分為含藥血清組和生理鹽水血清組，每組10只，含藥血清組給予健骨顆粒2g·kg-1·d-1，空白血清組灌服生理鹽水2ml·d-1，二組均連續(xù)灌胃7天，腹主動脈取血制備健骨顆粒含藥血清和生理鹽水血清。 3檢測指標：MTT法檢測不同含藥血清濃度對成骨細胞增殖的影響，得出最佳含藥血清濃度；以最佳濃度的含藥血清作用于成

3、骨細胞至7天，收集細胞液，以生理鹽水血清干預的細胞為對照，采用酶聯免疫吸附法檢測成骨細胞OCN濃度，比色法測HYP、AKP含量；收集細胞：實時熒光定量PCR法檢測Cbfa1、ColⅠ、OSXmRNA表達：取第4代細胞按6×105/ml的密度接種于12孔板，連續(xù)觀察15天，采用茜素紅染色法染色礦化結節(jié)。 三、結果 1、MTT法檢測顯示健骨顆粒含藥血清濃度為20%時，體外培養(yǎng)成骨細胞增殖速度最快，明顯快于同濃度生理鹽水血清組

4、。 2、鈣化結節(jié)觀察顯示：15%、20%、30%、生理鹽水組都在不同的時間內出現了結節(jié)，含藥血清20%組最先出現礦化結節(jié)，15%、30%組次之。觀察還發(fā)現與生理鹽水血清組比較含藥血清組有結節(jié)數量增多的趨勢。 3、細胞液內OCN含量：酶聯免疫吸附法顯示，隨天數的增加生理鹽水血清組與含藥血清組細胞液內OCN含量均逐漸上升，第4天OCN含量最高，然后隨培養(yǎng)天數的增加逐漸下降，含藥血清組OCN含量均高于同濃度生理鹽水血清組，兩組

5、比較均有顯著性差異。 4、細胞液內AKP、HYP含量：比色法顯示，含藥血清組和生理鹽水血清組細胞液內AKP、HYP含量均隨天數的增加逐漸增多，但含藥血清組AKP、HYP含量均高于生理鹽水血清組，兩組比較有顯著性差異。 5、成骨細胞Cbfa1、ColⅠ、OSX基因mRNA表達：實時熒光定量PCR法檢測結果顯示，前3天含藥血清組成骨細胞中Cbfa1基因mRNA表達水平均高于生理鹽水組，兩組相比有顯著性差異，第7天兩組之間無顯

6、著性差異。第1、2、3、7天含藥血清組成骨細胞中ColⅠ、OSX基因的mRNA表達水平均高于生理鹽水血清組，兩組相比有顯著性差異。 四、結論 1、補腎健脾中藥健骨顆粒能提高體外培養(yǎng)成骨細胞中AKP、HYP、OCN含量，增加礦化結節(jié)數量，增強ColⅠ、Cbfa1、OSXmRNA的表達，說明健骨顆粒具有明顯促進成骨細胞分化成熟的作用。 2、健骨顆粒促進成骨細胞分化成熟的作用機制可能過程為：補腎健脾→上調最關鍵的特異性