參附注射液預處理對缺氧-復氧心肌細胞延遲性保護作用的實驗研究.pdf

1、目的：研究參附注射液預處理對缺氧/復氧心肌細胞的延遲保護作用的量效、時效關系并探討其可能機制。 方法：本實驗采用原代培養(yǎng)的新生SD大鼠心肌細胞，建立細胞缺氧/復氧模型。采用細胞存活率和凋亡率(流式細胞術(shù))、培養(yǎng)液中LDH活性(細胞LDH漏出率，全自動生化分析儀測定)、細胞培養(yǎng)液中MDA活性(細胞MDA漏出率，硫代巴比妥鈉比色法)作為細胞受損指標，觀察終濃度為1 00、200、400ul/ml的參附注射液預處理以及預處理6、12、

2、24、48、72、96h后對心肌細胞缺氧/復氧損傷的影響，并同時觀察ERKs上游激酶MEK-1/2抑制劑PD098059及反義HW-1α對參附注射液預處理誘導的心肌細胞延遲性保護作用及其誘導的HIF-1α表達的影響。具體實驗分組如下： 1．參附注射液預處理對缺氧，復氧心肌細胞的延遲保護作用的量效關系的實驗研究：培養(yǎng)的細胞隨機進入各實驗分組：①空白對照(Control)組：細胞置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)28(2+24+2)h；②缺氧/復

3、氧(H/R)組：細胞缺氧2h后復氧，常氧培養(yǎng)2h：③缺氧預處理(HPC)組：細胞缺氧20min，復氧后置培養(yǎng)箱內(nèi)常氧培養(yǎng)24h，然后再進行H/R操作；④～⑥100ul/ml、200ul/ml、400ul/ml參附注射液預處理(SF-100、SF-200、SF-400)組：含不同濃度(100ul/ml、200ul/ml、400ul/ml)參附注射液的無血清培養(yǎng)基預孵育細胞10min，更換預平衡的無血清培養(yǎng)基后置培養(yǎng)箱內(nèi)常氧培養(yǎng)24h，然后

4、進行H/R操作。 2．參附注射液預處理對缺氧，復氧心肌細胞的延遲保護作用的時效關系的實驗研究：采用實驗1確定的最佳預處理濃度(200ul/ml)，按如下分組進行實驗：①Control組，②H/R組，③HPC組，④～⑨參附注射液預處理后6h、12h、24h、48h、72h、96h缺氧/復氧(SF-6、SF-12、SF-24、SF-48、SF-72、SF-96)組。 3．反義HIF-1α及ERK通路抑制劑PD098059對參

5、附注射液預處理誘導的心肌細胞延遲性保護作用的影響的實驗研究：采用實驗1確定的最佳預處理濃度(200ul/ml)預處理心肌細胞并在實驗2確定的最佳保護作用時段(預處理后12h)內(nèi)進行H/R操作，具體分組如下：①Control組，②H/R組，③HPC組，④參附注射液預處理(SF)組，⑤參附注射液+反義HIF-1a(SF+iHIF-la)組：參附注射液預處理前用含5.0umol/L的反義HIF-1a培養(yǎng)基預孵育細胞lOmin，其余步驟同④；⑥

6、參附注射液+PD098059(SF+PD098059)組：參附注射液預處理前用終濃度為50μmol/L的PD098059預孵育細胞10min，其余步驟同④。?、佗邰堍藿M細胞進行Western Blot檢測心肌細胞HIE-la蛋白表達量。 結(jié)果：1.與對照組相比，H/R組細胞存活率降低34.20％而凋亡率增加22.15％(p<0.05)，LDH和MDA漏出率分別增加110.26％、51.22％(p<0.05)。而HPC組與H/R組

7、相比，細胞存活率增加22。16％，凋亡率降低11.34％(p<0.05)，LDH和MDA漏出率分別減少70.77％、37.43％(p<0.05)。2.100、200、400ul/ml濃度參附注射液預處理組較H/R組相比，細胞存活率分別增加5.90％、20.20％、20.86％(p<0.05)，凋亡率分別降低8.29％、8.59％、8.44％(p<0.05)，LDH和MDA漏出率分別減少34.52％、58。50％、52。74％和27.72

8、％、33。7l％、31.25％(p<0.05)。其中100ul/ml參附注射液預處理組與H/R組比較無顯著性差異(p>0.05)，200、400ul/ml參附注射液預處理組與H/R組相比有顯著性差異(p<0.05)，但與HPC組及二者之間并無顯著性差異(p>0.05)。3.SF-6、SF-12、SF-24、SF-36、SF-48、SF-72參附注射液預處理組較H/R組相比，細胞存活率分別增加5.14％、15.75％、20.20％、20.

9、52％、19.66％、17.81％而凋亡率分別降低4.82％、10.80％、8.59％、8.74％、7.68％、8.26％(p<0.05)，LDH和MDA漏出率分降低34。32％、43.26％、58.50％、57.63％、59.92％、58.29％和20.47％、30.38％、33.69％、30.83％、3 1.78％、29.75％(p<0.05)。除SF-6組與HPC組相比有顯著性差異外(p>0.05)，其余各組與HPC組相比無顯著性

10、差異且組間無顯著性差異(p<0.05)。4.HPC組、sF組與H/R組相比，細胞存活率分別增加22.16％、20.20％，凋亡率分別降低11.34％、8.59％，LDH和MDA漏出率分別減少70.77％、58.50％和37.43％、33.71％，此兩組結(jié)果與H/R組相比有顯著差異(p<0.05)且此兩組間差異無顯著性(p>0.05)。而SF組+反義HIF-lα組、SF組+PD098059組與H/R組相比，細胞生存率分別增加6.04％、7

11、.89％而凋亡率分別減少4.59％、5.41％，LDH和MDA漏出率較H/R組分別減少10.91％、17.69％和11.76％、12.57％，結(jié)果無顯著差異(p>0.05)；但此兩組與HPC組相比，細胞生存率分別減少16.12％、14.27％，LDH和MDA漏出率較H/R組分別增加59.86％、53.08％和24.67％、23.86％，結(jié)果有顯著性差異(p<0.05)。5.Western Blot結(jié)果顯示：對照組HIF-1α所在的120

12、kD蛋白條帶灰度值為0.427，HPC組為0.837，SF組為0.783，后二組較對照組分別高0.410和0.356(p<0.01)，且后二組間無顯著性差異(p<0.01)，而PD098059組HIF-1α表達(灰度值為0.566)與SF組及HPC組相比則明顯受到抑制(p<0.05). 結(jié)論：1.參附注射液預處理可以模擬缺氧預處理對缺氧/復氧乳鼠心肌細胞延遲性保護作用； 2.200μl/ml的參附注射液預處理即可誘導對缺氧/復氧