竹紅菌素修飾納米脂質(zhì)微泡聯(lián)合LED光源照射人舌癌細(xì)胞Tca8113的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　1.實(shí)驗(yàn)室自制竹紅菌素修飾的納米脂質(zhì)微泡，并測(cè)定其粒徑大小、電位、包封率等物理性質(zhì);將HB溶于DMSO中，用UV-2102PC紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，確定檢測(cè)波長(zhǎng)。
　　2.常規(guī)培養(yǎng)人舌癌細(xì)胞，觀察竹紅菌素修飾納米脂質(zhì)微泡在細(xì)胞中的吸收代謝規(guī)律，選定最佳時(shí)間，而后聯(lián)合LED光源照射觀察對(duì)癌細(xì)胞的作用。
　　方法:
　　第一部分1.制作微泡實(shí)驗(yàn)室機(jī)械振蕩法自制竹紅菌素修飾納米脂質(zhì)微泡以及空白微泡，分別用馬爾

2、文激光粒徑測(cè)量?jī)x、Malvern表面電位檢測(cè)儀、UV-2102PC紫外分光光度計(jì)側(cè)定其粒徑、電位、包封率。2.實(shí)驗(yàn)室配置成溶劑為DMSO，溶質(zhì)為HB，濃度為1mg/ml的棕黃色液體，加入到100ml含5％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，稀釋成HB終濃度為0.5μM，用UV-2102PC紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)400nm-700nm范圍內(nèi)連續(xù)掃描，可得出HB的吸收光譜圖，選取最高值作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件。
　　第二部分1.細(xì)胞培養(yǎng)在含5

3、％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)Tca8113細(xì)胞。2.竹紅菌素修飾脂質(zhì)微泡的吸收代謝規(guī)律取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Tca8113細(xì)胞，加入含20μM納米光敏劑的RPMI1640，分別培養(yǎng)2h，4h，6h，8h，10h，12h，PBS沖洗兩次，離心兩次后用DMSO裂解細(xì)胞，放置30分鐘。用分光光度計(jì)檢測(cè)熒光值，激發(fā)波長(zhǎng)為475nm，發(fā)射波長(zhǎng)為600nm。3.觀察HB修飾脂質(zhì)微泡聯(lián)合LED光源照射對(duì)細(xì)胞Tca8113的作用于96孔板中加

4、入處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Tca8113細(xì)胞，每孔2*104個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，將細(xì)胞培養(yǎng)到次日加入HB修飾的微泡，濃度為0-10μmol/L。孵育6小時(shí)后在暗室內(nèi)進(jìn)行光照處理，能量密度為0-3J/cm2，波長(zhǎng)為475nm，繼續(xù)培養(yǎng)18小時(shí)，用MTT法檢測(cè)各孔吸光度值OD值，按照以下公式計(jì)算各組細(xì)胞的抑制率，細(xì)胞抑制率(％)-（對(duì)照組的OD-處理組的OD值）/對(duì)照組的OD值*100％，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)計(jì)算三次。4.流式觀察HB修飾脂質(zhì)微泡聯(lián)

5、合LED光源照射對(duì)細(xì)胞Tca8113的作用將細(xì)胞分成五組，①實(shí)驗(yàn)細(xì)胞組:HB微泡濃度10μM，光能量為3 J/cm2;②空白對(duì)照組:HB微泡濃度0μM，光能量為0J/cm2;③單純光照組:HB微泡濃度0μM，光能量為3J/cm2;④單純HB微泡組:HB微泡濃度10μM，光能量為0J/cm2;⑤空白微泡組:空白微泡濃度10μM，光能量為3J/cm2;各組按分組要求微泡處理6h后，再光照18h后按要求對(duì)細(xì)胞AnnexinV-FITC/PI進(jìn)

6、行雙染，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)果:
　　第一部分1.竹紅菌素修飾的微泡為納米級(jí)，其粒徑為(1050.4±323.0)nm，Zeta電位為+(21.3±7.3)mV，包封率為（85.1±4.6）％;空白微泡粒徑為(1029.8±134.0)nm，Zeta電位為+(20.9±8.6)mV。
　　2.竹紅菌乙素在吸收光譜圖上有三個(gè)吸收峰，分別為475nm、545nm，在475nm處為最高峰值。
　　第二部分

7、1.細(xì)胞中竹紅菌素脂質(zhì)微泡吸收隨時(shí)間變化而變化，6小時(shí)達(dá)最佳，6小時(shí)后細(xì)胞內(nèi)竹紅菌素的含量呈平臺(tái)且有下降趨勢(shì)。
　　2.HB微泡聯(lián)合LED光源照射細(xì)胞有明顯抑制作用，在一定范圍內(nèi)抑制作用跟HB微泡濃度呈整相關(guān)。
　　3.除實(shí)驗(yàn)細(xì)胞組以外，其余四組凋亡率及死亡率較低，無明顯差異(p＞0.05)，其中空白微泡組凋亡率及其死亡率稍高，但仍無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞組凋亡率及其死亡率較高，較其余四組有明顯差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.0