縮小型抗金黃色葡萄球菌靶向工程多肽.pdf

1、由于抗生素的濫用和耐藥菌株的不斷出現,特別是耐甲氧西林和耐萬霉素金黃色葡萄球菌的出現,使人類對金黃色葡萄球菌感染的控制受到了嚴重的挑戰(zhàn),因此在合理使用抗生素的同時更要發(fā)展新型的抗生素.而組裝出滿足人類需要的多結構域蛋白質機器是二十一世紀分子生物學工作的前沿之一.大腸菌素Ia是可形成離子通道的一種細菌素,其通道結構域(D451—I626)能在同種異株的大腸桿菌內膜上形成致死性離子通道.然而由于其信號識別結構域只能識別大腸桿菌內膜上形成致死

2、性離子通道.然而由于其信號識別結構域只能識別大腸桿菌外膜和內膜上的特異受體,因此野生型大腸菌素難以拓展成為對抗它種細菌的抗菌素.上世紀九十年代人們逐步確定了革蘭氏陽性菌分泌的調節(jié)同種細菌生長和毒素產生的信息素多是由數個或數十個氨基酸殘基組成的多肽,具有自主尋找同種菌胞膜受體的生物學活性.丘小慶等利用信息素的自主導向特性和大腸菌素Ia的致死性通道特性構建了由金黃色葡萄球菌信息素AgrD和大腸菌素Ia組成的融合蛋白,命名為Pheromoni

3、cin,該蛋白表現出了信息素和大腸菌素Ia都不具有的抗金黃色葡萄球菌活性.但這樣的融合蛋白尚有大腸菌素Ia兩個與抗金黃色葡萄球菌活性無關的信號識別結構域,從理論上講還不屬于純粹的多結構域蛋白質分子機器,因而該研究將進一步裁減掉大腸菌素Ia的非通道形成肽鏈,利用大腸菌素Ia的水性孔道結構域(K544—I626)和金黃色葡萄球菌信息素AgrD構建結構上更緊湊的多結構域蛋白質分子機器(Engineered multidomain protei

4、n machine).利用點突變方法將金黃色葡萄球菌信息素AgrD(Ⅰ型,YSTCDFIM)的基因引入到大腸菌素Ia羧基端I626基因上,并將限制性內切酶SacⅠ酶切位點基因分別引入到大腸菌素Ia的P4和K544上,通過酶切、膠回收、連接獲得含大腸菌素Ia水性孔道結構域和金黃色葡萄球菌信息素AgrD基因的重組質粒.將重組質粒轉化入大腸桿菌TG1工程菌中,生產構建的工程多肽,離子交換純化后獲得工程多肽初步純化產物,體外抗菌試驗、藥物撤離試

5、驗檢測工程多肽的抗菌活性,在人工脂質膜上測定其形成離子通道的特性以初步研究抗菌機理,并觀察其對真核細胞的毒性作用.實驗結果表明:縮小型抗金黃色葡萄球菌靶向人工多肽能在金黃色葡萄球菌信息素AgrD的誘導下,在其細胞膜上形成致死性離子通道,因而具有抗金黃色葡萄球菌的生物活性,對耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌也表現出了較強的抗菌活性,因而該工程多肽極具發(fā)展成為抗耐藥金黃色葡萄球菌藥物的潛在價值,同時它也是將兩個來自不同種源蛋白質,生物活性截然不同