ATP敏感的線粒體鉀通道開放劑介導延遲預處理的機制研究.pdf

1、自1950年Bigelow第一次在心臟手術(shù)中引入心肌保護的概念后,隨著不斷成熟的低溫體外循環(huán)技術(shù)及心肌灌注停跳液的改進,使手術(shù)中的心肌保護已經(jīng)取得了巨大的進步.然而這些都遠遠沒達到我們預期的效果,尤其在嬰幼兒心臟手術(shù)中,由于大部分先天性心臟病患兒的心肌術(shù)前處于紫紺缺氧狀態(tài),易受到傷害,這個問題就更為突出<'[2]>. 缺血預處理(Ischemic Preconditioning,IPC)是指短期缺血應激使機體組織對隨后的更長時間缺血再灌

2、注損傷產(chǎn)生明顯保護作用的一種適應性機制.它是由1986年由Murry及其合作者發(fā)現(xiàn)的,目前IPC已經(jīng)公認的目前最強的內(nèi)源性心肌保護措施,但是其確切機制仍未明確<'[2]>.缺血預處理分為兩個階段,即刻出現(xiàn)為典型缺血預處理階段,只能持續(xù)2～3小時;12～24小時后,進入延遲預處理階段.延遲預處理可以持續(xù)3～4天.因此延遲預處理具有更大的臨床應用價值. 由于對于缺血預處理講要想獲得這種心肌自身內(nèi)在的抗損傷機制,必須先以接受缺血預適應

3、的損傷為代價.到目前為止,缺血預適應在心臟外科并未得到廣泛的應用,因此許多學者提出用藥物模擬缺血預處理.藥物預處理的研究最初是通過對缺血預處理保護機制的理解,利用能夠激動IPC信號傳導某一階段的藥物模擬其作用.現(xiàn)已經(jīng)證實的低劑量亦具有誘導心臟保護的藥物包括線粒體鉀通道(ATP-sensitive potassium channel,mitoKATP)開放劑、吸入性麻醉藥和阿片類麻醉藥、腺苷等. 本實驗從新生鼠中分離出心肌細胞,以

4、缺氧/無血清(Hypoxia/SD)模型模擬體內(nèi)養(yǎng)分匱乏和低氧的缺血微環(huán)境,建立未成熟心肌的體外缺氧的細胞膜型<'[5]>,研究在此條件下mitoKATP開放劑DZX介導的延遲預處理對心肌的保護作用.并且觀察吡咯烷二硫基甲酸鹽(Pyrrolidinecarbodithioate,PDTC)作為NFκB的特異拮抗劑<'[6]>,是否能較為完全的阻斷DZX介導延遲預處理的心肌保護作用.并初步探究討其機制,力圖為DZX最終在未成熟心肌保護的臨

5、床應用提供實驗依據(jù). 目的 體外模擬機體缺血缺氧環(huán)境,觀察DZX介導的延遲預處理對心肌的保護作用,并證明mitoKATP開放后進一步激活NF-κB,從而促進各種保護基因的表達而產(chǎn)生對心肌的保護作用.為DZX在未成熟心肌保護的臨床應用提供實驗依據(jù). 方法 1.分離培養(yǎng)出生1～3天的SD(Spragde DaWley)大鼠的心肌細胞待用<[7]>. 2.將乳鼠的心肌細胞隨機分為缺氧組、DZX組、DZX

6、+PDTC組和對照組. 3.DZX組于細胞缺氧培養(yǎng)前24小時放入含100μmol/L的DZX的培養(yǎng)液15分鐘;DZX+PDTC組于細胞缺氧培養(yǎng)前24小時放入含100μmol/LDZX和500μmol/L PDTC的培養(yǎng)液15分鐘;對照組及缺氧組則放入含空白溶劑的培養(yǎng)液15分鐘. 4.用缺氧袋、缺氧罐和無血清培養(yǎng)液建立Hypoxia/SD模型模擬體內(nèi)的缺血缺氧環(huán)境<'[5]>,將缺氧組、DZX組、DZX+PDTC組心肌細胞

7、放進行無氧培養(yǎng)16小時,繼之2小時的有氧培養(yǎng).對照組則一直有氧培養(yǎng). 5.檢測各項指標:Hoechst染色,Annexin V/PI流式檢測凋亡細胞,WesternBlot檢測心肌細胞Bax和Bcl-2的表達,生色底物法檢測Caspase-3酶活性. 結(jié)果 1.與對照組比較缺氧組明顯出現(xiàn)大量心肌細胞凋亡,尤以早期凋亡最為明顯,Annexin V/PI法流式檢測、Hoechst染色、Caspase-3酶活力的測定均

8、支持這一結(jié)果. 2.與缺氧組比較DZX組能明顯的抑制Hypoxia/SD誘導的乳鼠心肌細胞凋亡,流式檢測細胞凋亡降低明顯.Hoechst染色、Caspase-3酶活力的測定也都說明DZX組乳鼠心肌細胞凋亡減少. 3.與DZX組比較DZX+PDTC組乳鼠心肌細胞凋亡明顯增多,提示NF-kB是DZX介導的延遲預處理機制的下游關(guān)鍵通路. 4.Western blot檢測顯示DZX組與DZX+PDTC組、缺氧組比較Bcl

9、-2表達增加,Bax表達減少,Bcl-2/Bax比值升高明顯,提示DZX介導的延遲預處理機制與Bcl-2和Bax調(diào)控相關(guān). 結(jié)論：本實驗建立Hypoxia/SD模型能成功的模擬機體缺血缺氧環(huán)境.在體外細胞試驗中,mitoKATP開放劑DZX介導的延遲預處理對心肌的有明顯的保護作用.而位于mitoKATP下游的NF-kB的激活則在未成熟心肌的延遲預處理中起著關(guān)鍵作用.此外NF-KB通過調(diào)控促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表