番茄斑萎病毒(TSWV)的分子進化及其亞基因組翻譯調控的研究.pdf

1、番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）是布尼亞病毒科（Bunyaviridae）番茄斑萎病毒屬（Tospovirus）的代表種，其基因組包括三條單鏈RNA（L、M和S）：RNA L（約8.9kb）為負義RNA，其互補鏈編碼RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp），RNA M和RNA S均為雙義RNA，其中M編碼非結構蛋白NSm以及糖蛋白Gn-Gc，S編碼非結構蛋白NSs以及核衣殼蛋白N。由RNA M和S

2、編碼的4個蛋白（NSm、Gn-Gc、NSs和N）分別從4個亞基因組上表達，但關于其精確的3’末端定位未見報道。
　　本文首先通過RT-PCR克隆得到來自中國云南省不同發(fā)病寄主（煙草，辣椒，甜椒）上的TSWV全基因組序列。通過對Genbank數據庫中所有的29個L，62個M和66個S基因組序列統(tǒng)計發(fā)現：
　　1.M和S基因組的長度變化較L更為明顯；
　　2.有蛋白編碼區(qū)的長度幾乎沒有變化；
　　3.M和S基因組的長

3、度變化與各自的基因組間隔區(qū)（IGR）的長度變化密切相關。
　　然后，通過DNAMAN軟件分析5個中國分離物間的核苷酸和氨基酸的分子變異，同時利用MEGA5.0軟件對世界范圍內的TSWV分離物進行系統(tǒng)進化樹分析。
　　結果顯示：
　　1.本文克隆的三個TSWV中國分離物與TSWV中國番茄分離物的親緣關系較近；而與TSWV中國萵苣分離物的遺傳距離很遠；
　　2.TSWV的不同分離物間存在明顯的RNA重排現象。利用RD

4、P4軟件對世界范圍內的TSWV分離物的重組分析發(fā)現了高頻率的重組事件，而發(fā)生在負鏈RNA病毒間的RNA重組之前只有少數報道，且均為低頻率重組；并且在TSWV中發(fā)生的重組存在明顯的區(qū)域選擇性；重組大多發(fā)生在RNA的5’部分，其中在RNA M和S中尤為顯著。
　　為精細研究TSWV亞基因組的翻譯調控，通過3’-RACE對TSWV中國煙草分離物RNA M（KM657118）和RNA S（KM657115）產生的亞基因組（sgRNA）進行

5、3’末端定位，測序結果亞基因組sgRNA-NSm的3’末端對應于RNA M的A1080，長度為1080 nt；亞基因組sgRNA-(Gn-Gc)的3’末端互補于RNA M的U1200，長度為3573nt；亞基因組sgRNA-NSs的3’末端對應于RNA S的C1702，長度為1702nt；亞基因組sgRNA-N的3’末端互補于RNA S的A1865，長度為1106nt。利用DNAMAN的序列比對發(fā)現，雖然不同TSWV的RNA M和S的I

6、GR區(qū)的長度與核苷酸序列存在較大差異，但亞基因組的3’末端堿基及其鄰近序列則非常保守。所有來自RNA M和S的亞基因組的3’UTR只包括各自IGR的一部分，并且利用Mfold的RNA二級結構預測表明，亞基因組的3’末端堿基均位于基因間隔區(qū)（IGR）的莖環(huán)結構的莖部，且與其亞基因組編碼蛋白同側。
　　利用螢火蟲熒光素酶（Fluc）的報告基因載體研究TSWV RNAS的亞基因組翻譯調控，將相應亞基因組的5’UTR和3’UTR分別插入到

7、Fluc的上下游，根據研究結果進行后續(xù)的突變分析。主要結果如下：
　　1.亞基因組（sgRNA-NSs、sgRNA-N）5’UTR對于Fluc翻譯有正調控作用；在5’UTR存在的前提下，亞基因組3’UTR則會進一步增強翻譯，即亞基因組5’UTR和3’UTR協(xié)同調控翻譯；
　　2.缺失突變分析發(fā)現，5’UTR的1-15nt核苷酸對增強翻譯至關重要；并且反式競爭實驗表明，亞基因組5’UTR對翻譯的增強作用可能通過結合核糖體或翻譯